Idi na sadržaj

Agaroza

Nepregledano
S Wikipedije, slobodne enciklopedije
Agarozni gel u posudi
koja se koristi za gel-elektroforezu

Agaroza jest polisaharid, koji se obično ekstrahuje iz određenih crvenih algi.[1] To je linearni polimer sastavljen od ponavljajuće jedinice agarobioze, koja je disaharid sastavljen od D-galaktoze i 3,6-anhidro-L-galaktopiranoze.[2][3] Agaroza je jedna od dvije glavne komponente agara i pročišćava se iz agara, uklanjanjem druge komponente agara, agaropektina.[4] Agaroza koristi se često u molekularnoj biologiji za odvajanje velikih molekula, posebno DNK, putem elektroforeza. Ploče agaroznih gelova (obično 0,7 – 2%) za elektroforezu lahko se pripremaju izlijevanjem toplog, tekućeg rastvora u kalup. Različite agaroze različitih molekularnih težina i svojstava su komercijalno dostupne za ovu svrhu. Agaroza može se oblikovati u kuglice i koristiti u brojnim hromatografskim metodama za prečišćavanje proteina. Također se može koristiti umjesto agara kao čvrsti medij za kultiviranje ćelija i organizama.

Struktura

[uredi | uredi izvor]
Struktura ponavljajuće jedinice agaroznog polimera.

Agaroza je linearni polimer molekularne težine od oko 120.000, koji se sastoji od naizmjeničnih D-galaktoza i 3,6-anhidro-L-galaktopiranoza povezanih α-(1→3) i β-(1→4) glikozidnim vezama. 3,6-anhidro-L-galaktopiranoza jeste L-galaktoza s anhidro mostom između pozicija 3 i 6, iako neke L-galaktozne jedinice u polimeru možda ne sadrže most. Neke D-galaktozne i L-galaktozne jedinice mogu biti metilirane, a u malim količinama također se nalaze i piruvat i sulfat.[5] Svaki agarozni lanac sadrži ~800 molekula galaktoze, a agarozni polimerni lanci formiraju spiralna vlakna koja se agregiraju u superspiralnu strukturu radijusa od 20–30 nanometara (nm).[6] Vlakna su kvazi-kruta i imaju širok raspon dužine ovisno o koncentraciji agaroze.[7] Kada se očvrsnu, vlakna formiraju trodimenzijsku mrežu kanala promjera u rasponu od 50 nm do >200 nm, ovisno o korištenoj koncentraciji agaroze – veće koncentracije daju niže prosječne promjere pora. Trodimenzijska struktura drži se zajedno vodikovim vezama i stoga se može poremetiti zagrijavanjem natrag u tekuće stanje.

Svojstva

[uredi | uredi izvor]

Agaroza je dostupna kao bijeli prah koji se rastvara u gotovo kipućoj vodi, a kada se ohladi, formira gel. Agaroza pokazuje fenomen termičke histereze, u svom prijelazu iz tekućine u gel, tj. gelira i topi se na različitim temperaturama. Temperature želiranja i topljenja variraju ovisno o vrsti agaroze. Standardne agaroze izvedene iz algi roda Gelidium imaju temperaturu želiranja od 34 –38 C i temperaturu topljenja od 90 – 95 C, dok one izvedene iz algi roda Gracilaria, zbog svojih viših metoksi supstituenata, imaju temperaturu želiranja od 40–52 C i temperaturu topljenja od 85 – 90 C.[8] Temperature topljenja i želiranja mogu zavisiti od koncentracije gela, posebno pri niskoj koncentraciji gela manjoj od 1%. Temperature želiranja i topljenja stoga su date pri određenoj koncentraciji agaroze. Prirodna agaroza sadrži nenabijene metilne grupe i stepen metilacije je direktno proporcionalan temperaturi želiranja. Međutim, sintetska metilacija ima suprotan efekat, pri čemu povećana snižava temperaturu želiranja.[9] Različite hemijski modificirane agaroze s različitim temperaturama topljenja i želiranja dostupne su putem hemijskih modifikacija. Agaroza u gelu formira mrežu koja sadrži pore, a veličina pora ovisi o koncentraciji dodane agaroze. Nakon stajanja, agarozni gelovi skloni su sinerezi (izlasku vode kroz površinu gela), ali je proces dovoljno spor da ne ometa upotrebu gela.[10][11]

Agarozni gel može imati visoku čvrstoću gela pri niskoj koncentraciji, što ga čini pogodnim kao antikonvekcijski medij za gel elektroforezu. Agarozni gelovi razrijeđeni čak i do 0,15% mogu formirati ploče za gel elektroforezu.[12] Agarozni polimer sadrži nabijene grupe, posebno piruvat i sulfat.[9] Ove negativno nabijene grupe mogu usporiti kretanje molekula DNK. u procesu koji se naziva elektroendosmoza (EEO). Agaroza s niskim EEO (LE) je stoga općenito poželjna za upotrebu u agaroznoj gel-elektroforezi nukleinskih kiselina. Dostupne su i agaroze s nultom EEO, ali one mogu biti nepoželjne za neke primjene jer se mogu napraviti dodavanjem pozitivno nabijenih grupa koje mogu uticati na naknadne enzimske reakcije.[13] Elektroendosmoza razlog je zašto se agaroza koristi preferirano u odnosu na agar, budući da agaropektin u agaru sadrži značajnu količinu negativno nabijenih sulfatnih i karboksilnih grupa. Uklanjanje agaropektina u agarozi značajno smanjuje EEO, kao i nespecifične adsorpcije biomolekula na matricu gela. Međutim, za neke primjene, kao što je elektroforeza serumskih proteina, visok EEO može biti poželjan, a agaropektin se može dodati u korišteni gel.[14] Smatra se da je LE agaroza bolja za preparativnu elektroforezu, tj. kada je potrebno ekstrahovati DNK iz agaroznog gela.[15]

Agaroze na niskim temperaturama topljenja i želiranja

[uredi | uredi izvor]

Temperature topljenja i želiranja agaroze mogu se modificirati hemijskim modifikacijama, najčešće hidroksietilacijom, koja smanjuje broj vodikovih veza unutar lanca, što rezultira nižim temperaturama topljenja i želiranja u poređenju sa standardnim agarozama.[16] Tačna temperatura određena je stepenom supstitucije, a mnoge dostupne agaroze sa niskom tačkom topljenja (LMP) mogu ostati tečne u rasponu od 30 do 35 °C. Ovo svojstvo omogućava enzimske manipulacije direktno nakon elektroforeze DNK gela, dodavanjem kriški rastopljenog gela koji sadrže DNK fragment od interesa u reakcijsku smjesu. LMP agaroza sadrži manje sulfata koji mogu uticati na neke enzimske reakcije i stoga se poželjno koristi za neke primjene. Hidroksietilirana agaroza također ima manju veličinu pora (~90 nm) od standardnih agaroza.[17] Hidroksietilacija može smanjiti veličinu pora, smanjenjem gustoće pakiranja agaroznih snopova; stoga LMP gel također može uticati na vrijeme i separaciju tokom elektroforeze.[18] Ultra-low melting or gelling temperature agaroses may gel only at 8–15 °C (46–59 °F).

Aplikacije

[uredi | uredi izvor]
Agarozni gel sa trakama DNK obojenim etidij-bromidom i vizualiziranim pod ultraljubičastim svjetlom na UV transiluminatoru.

Agaroza je preferirana matrica za rad sa proteinima i nukleinskim kiselinama jer ima širok raspon fizičke, hemijske i termičke stabilnosti, a njen niži stepen hemijske složenosti također smanjuje vjerovatnoću interakcije sa biomolekulama. Agaroza se najčešće koristi kao medij za elektroforezu analitičkog obima u elektroforezi na agaroznom gelu. Gelovi napravljeni od prečišćene agaroze imaju relativno velike pore, što ih čini korisnim za odvajanje velikih molekula, kao što su proteini i proteinski kompleksi >200 kilodaltona, kao i fragmenti DNK >100 baznih parova. Agaroza se također široko koristi za niz drugih primjena, na primjer za imunodifuziju i imunoelektroforezu, jer agarozna vlakna mogu funkcionirati kao sidro za imunokomplekse.

Elektroforeza na agaroznom gelu

[uredi | uredi izvor]

Elektroforeza na agaroznom gelu rutinska je metoda za razdvajanje DNK u laboratoriji. Agarozni gelovi imaju nižu moć razdvajanja za DNK od akrilamidnih gelova, ali imaju veći raspon razdvajanja i stoga se obično koriste za fragmente DNK dužine 50–20.000 bp (bazni pars), iako je razdvajanje preko 6 Mb moguće uz elektroforezu pulsirajućeg polja na gelu (PFGE).[19] Također može se koristiti za odvajanje velikih molekula proteina i preferirana je matrica za gel elektroforezu čestica s efektivnim radijima većim od 5–10 nm.[12] Veličina pora gela utiče na veličinu DNK koja se može prosijati. Što je niža koncentracija gela, to su veće pore i veća je DNK koja se može prosijati. Međutim, gelovi niske koncentracije (0,1 – 0,2%) krhki su i stoga teški za rukovanje, a elektroforeza velikih molekula DNK može se obraditi nekoliko dana. Granica rezolucije za standardnu ​​elektroforezu na agaroznom gelu je oko 750 kb.[19] Ovo ograničenje se može prevazići PFGE metodom, gdje se na gel primjenjuju naizmjenična ortogonalna električna polja. Fragmenti DNK preorijentišu se kada primijenjeno polje promijeni smjer, ali većim molekulima DNK treba više vremena da se preusmjere kada se električno polje promijeni, dok je za manje to brže, te se DNK stoga može frakcionirati prema veličini. Agarozni gelovi lijevaju se u kalupu, a kada se stvrdnu, obično se horizontalno uranjaju u puferski rastvor. Tris-acetat-EDTA i Tris-borat-EDTA puferi koriste se često, ali se drugi puferi poput Tris-fosfata, barbiturne kiseline-natrij barbiturata ili Tris-barbituratnog pufera mogu koristiti u drugim primjenama.[1] DNK vizualizira se obično bojenjem sa etidij-bromidom, a zatim se posmatra pod UV svjetlom, ali su dostupne i druge metode bojenja, kao što su SYBR-zelena, GelRed, metilensko plavo i kristal ljubičasto. Ako su odvojeni fragmenti DNK potrebni za daljnji eksperiment, mogu se izrezati iz gela u kriškama za daljnju manipulaciju.

Pročišćavanje proteina

[uredi | uredi izvor]
Kolone za gel filtraciju na bazi agaroze koje se koriste za prečišćavanje proteina na AKTA FPLC uređaju.

Matrica agaroznog gela se često koristi za prečišćavanje proteina, naprimjer, u preparativnoj separaciji na bazi kolone kao u gel-filtracijskoj hromatografiji, afinitetnoj hromatografiji i hromatografiji ionske izmjene. Međutim, ne koristi se kao kontinuirani gel, već se formira u porozne kuglice ili smole različite finoće.[20] Kuglice su vrlo porozne tako da protein može slobodno teći kroz njih. Ove kuglice na bazi agaroze uglavnom su mehke i lahko se drobe, pa ih treba koristiti pod postupcima gravitacijskog toka, centrifugiranja pri maloj brzini ili niskog pritiska.[21] Čvrstoća smola može se poboljšati povećanim umrežavanjem i hemijskim očvršćavanjem agaroznih smola; međutim, takve promjene mogu rezultirati i nižim kapacitetom vezivanja proteina u nekim postupcima separacije, kao što je afinitetna hromatografija.

Agaroza je koristan materijal za hromatografiju jer ne apsorbuje biomolekule u značajnoj mjeri, ima dobra svojstva protoka i može tolerisati ekstremne vrijednosti pH i ionske jačine, kao i visoku koncentraciju denaturansa kao što su 8M urea ili 6M gvanidin HCl.[22] Primjeri matrica na bazi agaroze za gel filtracijsku hromatografiju su Sepharose i WorkBeads 40 SEC (umrežena kuglična agaroza), Praesto i Superose (visoko umrežene kuglične agaroze) i Superdex (dekstran kovalentno vezan za agarozu).

Za afinitetnu hromatografiju, kuglična agaroza najčešće je korištena matrična smola za vezivanje liganada koji vežu proteine.[23] Ligandi jesu kovalentno povezani putem razmaknice za aktivirane hidroksilne grupe polimera agaroznih kuglica. Proteini od interesa se zatim mogu selektivno vezati za ligande kako bi se odvojili od drugih proteina, nakon čega se mogu eluirati. Korištene agarozne kuglice su obično gustoće 4% i 6% s visokim kapacitetom vezivanja za proteine.

Čvrsti mediji za kulturu

[uredi | uredi izvor]

Agarozna ploča ponekad se može koristiti umjesto agara za kultiviranje organizama jer agar može sadržavati nečistoće koje mogu utjecati na rast organizma ili neke naknadne postupke kao što je lančana polimerazna reakcija (PCR). Agaroza je također tvrđa od agara i stoga može biti poželjnija tamo gdje je potrebna veća čvrstoća gela, a njena niža temperatura želiranja može spriječiti izazivanje termičkog šoka kod organizma kada su ćelije suspendirane u tekućini prije želiranja. Može se koristiti za kulturu striktnih autotrofnih bakterija, biljnih protoplasta,[24] Caenorhabditis elegans,[25] drugi organizmi i razne ćelijske linije.

Testovi pokretljivosti

[uredi | uredi izvor]

Agaroza se ponekad koristi umjesto agara za mjerenje pokretljivosti i mobilnosti mikroorganizama. Pokretne vrste će moći migrirati, iako sporo, kroz porozni gel, a zatim se mogu vizualizirati brzine infiltracije. Poroznost gela je direktno povezana s koncentracijom agara ili agaroze u mediju, tako da se različiti koncentracijski gelovi mogu koristiti za procjenu pokretljivosti plivanja, rojenja, klizanja i pokretljivosti trzanja ćelije. Test migracije ćelija ispod agaroze može se koristiti za mjerenje hemotaksija i hemokineze. Sloj agaroznog gela se postavlja između ćelijske populacije i hemoatraktanta. Kako se gradijent koncentracije razvija od difuzije hemoatraktanta u gel, različite ćelijske populacije kojima su potrebni različiti nivoi stimulacije za migraciju mogu se vizualizirati tokom vremena, korištenjem mikrofotografije dok se probijaju kroz gel protiv gravitacije duž gradijenta.

Također pogledajte

[uredi | uredi izvor]

Reference

[uredi | uredi izvor]
  1. 1 2 Jeppsson JO, Laurell CB, Franzén B (april 1979). "Agarose gel electrophoresis". Clinical Chemistry. 25 (4): 629–38. doi:10.1093/clinchem/25.4.629. PMID 313856.
  2. ↑ Akari C (1956). "Structure of the agarose component of agar-agar". Bulletin of the Chemical Society of Japan. 29 (4): 543–544. doi:10.1246/bcsj.29.543.
  3. ↑ Agar Arhivirano 16. 10. 2007. na Wayback Machine at lsbu.ac.uk Water Structure and Science
  4. ↑ "Agar". Food and Agricultural Organization of the United Nations.
  5. ↑ Armisen R, Galatas F. "Chapter 1 - Production, Properties and Uses of Agar". Fao.org.
  6. ↑ Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J (1982). "Chapter 5, protocol 1". Molecular Cloning - A Laboratory Manual. 1. str. 5.4. ISBN 978-0879691363.
  7. ↑ Stephen AM, Phillips GO, ured. (2006). Food Polysaccharides and Their Applications. CRC Press. str. 226. ISBN 978-0824759223.
  8. ↑ Workshop on Marine Algae Biotechnology: Summary Report. National Academy Press. 1986. str. 25.
  9. 1 2 "Appendix B: Agarose Physical Chemistry" (PDF). Lonza Group. Arhivirano (PDF) s originala, 9. 10. 2022.
  10. ↑ Hill SE, Ledward DA, Mitchell JR, ured. (1998). Functional Properties of Food Macromolecules. Springer. str. 149. ISBN 978-0-7514-0421-0.
  11. ↑ Park H, Park K, Shalaby WS (1993). Biodegradable Hydrogels for Drug Delivery. CRC Press. str. 102. ISBN 978-1566760041.
  12. 1 2 Serwer P (1983). "Agarose gels: Properties and use for electrophoresis". Electrophoresis. 4 (6): 375–382. doi:10.1002/elps.1150040602. S2CID 97819634.
  13. ↑ Sambrook J, Russell D. "Chapter 5, protocol 1". Molecular Cloning - A Laboratory Manual. 1 (3rd izd.). str. 5.7. ISBN 978-0-87969-577-4.
  14. ↑ Keren D (26. 9. 2003). Protein Electrophoresis in Clinical Diagnosis. CRC Press. str. 7–8. ISBN 978-0340812136.
  15. ↑ Martin, Katherine. "Agarose LE vs. Agarose – What's the Difference?". Gold Biotechnology. Pristupljeno 19. 9. 2024.
  16. ↑ Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. "Chapter 5, protocol 6". Molecular Cloning - A Laboratory Manual. 1. str. 5.29. ISBN 978-0879695774.
  17. ↑ Griess, Gary A.; Moreno, Elena T.; Easom, Richard A.; Serwer, Philip (1989). "The sieving of spheres during agarose gel electrophoresis: Quantitation and modeling". Biopolymers. Wiley. 28 (8): 1475–1484. doi:10.1002/bip.360280811. ISSN 0006-3525.
  18. ↑ Lee PY, Costumbrado J, Hsu CY, Kim YH (april 2012). "Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments". Journal of Visualized Experiments. 62 (62): 3923. doi:10.3791/3923. PMC 4846332. PMID 22546956.
  19. 1 2 Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J (1982). "Chapter 5, protocol 1". Molecular Cloning - A Laboratory Manual. 1. str. 5.2–5.3. ISBN 978-0879691363.
  20. ↑ Freifelder D (1982). Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry and Molecular Biology (2nd izd.). WH Freeman. str. 240. ISBN 978-0716714446.
  21. ↑ "Overview of Affinity Purification". Thermo Scientific. Arhivirano s originala, 17. 10. 2013. Pristupljeno 17. 10. 2013.
  22. ↑ Freifelder D (1982). Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry and Molecular Biology (2nd izd.). WH Freeman. str. 258. ISBN 978-0716714446.
  23. ↑ Cuatrecasas P, Wilchek M (2004). Lennarz WJ, Lane MD (ured.). Encyclopedia of Biological Chemistry. 1. Academic Press. str. 52. ISBN 9780124437104.
  24. ↑ Bonga JM, von Aderkas P (1992). In Vitro Culture of Trees. Springer. str. 16. ISBN 978-0792315407.
  25. ↑ Caldwell GA, Williams SN, Caldwell KA (2006). Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. Wiley. str. 94–95. ISBN 978-0470095027.
Preuzeto iz "https://bs.wikipedia.org/w/index.php?title=Agaroza&oldid=3918382"