Dizajn proteina

Dizajn proteina je racionalni dizajn novih molekula proteina s ciljem dizajniranja nove aktivnosti, ponašanja ili svrhe, te unapređenja osnovnog razumijevanja funkcije proteina. Proteini se mogu dizajnirati od nule (de novo dizajn) ili pravljenjem izračunatih varijanti poznate strukture proteina i njegovog niza (nazvano redizajn proteina). Pristupi racionalnog dizajna proteina daju predviđanja o nizu proteina koji će se preklopiti u specifične strukture. Ovi predviđeni nizovi se zatim mogu eksperimentalno validirati metodama kao što su sinteza peptida, mutageneza usmjerena na mjesto ili sinteza vještačkog gena. Racionalni dizajn proteina datira iz sredine 1970-ih. Međutim, nedavno je bilo brojnih primjera uspješnog racionalnog dizajna vodotopivih, pa čak i transmembranskih peptida i proteina, dijelom zbog boljeg razumijevanja različitih faktora koji doprinose stabilnosti proteinske strukture i razvoju boljih računarskih metoda.

Pregled i historija

Cilj racionalnog dizajna proteina je predvidjeti aminokiseline sekvence primarne strukture proteina koje će se savijati u specifičnu proteinsku strukturu. Iako je broj mogućih proteinskih sekvenci ogroman i raste eksponencijalno s veličinom proteinskog lanca, samo će se podskup njih pouzdano i brzo saviti u jedno nativno stanje. Dizajn proteina uključuje identifikaciju novih sekvenci unutar ovog podskupa. Nativno stanje proteina je konformacijski slobodna energija minimum za lanac. Dakle, dizajn proteina je potraga za sekvencama koje imaju odabranu strukturu kao minimum slobodne energije. U određenom smislu, to je suprotno od [[predviđanje predviđanja strukture proteina. U dizajnu se specificira tercijarna struktura i identificira se sekvenca koja će se saviti u nju. Stoga se to naziva i "inverzno savijanje". Dizajn proteina je tada problem optimizacije: korištenjem nekih kriterija bodovanja odabire se optimizirana sekvenca koja će se saviti u željenu strukturu.

Kada su prvi proteini racionalno dizajnirani tokom 1970-ih i 1980-ih, sekvenca za njih je optimizirana ručno na osnovu analiza drugih poznatih proteina, sastava sekvence, naboja aminokiselina i geometrije željene strukture. Prvi dizajnirani proteini pripisuju se Berndu Gutteu, koji je dizajnirao reduciranu verziju poznatog katalizatora, goveđe ribonukleaze i tercijarne strukture koje se sastoje od beta-lista i alfa-heliksa, uključujući vezivo DDT. Urry i kolege kasnije su dizajnirali peptide slične elastinu, na osnovu pravila o sastavu sekvence. Richardson i saradnici su dizajnirali protein od 79 ostataka bez homologije sekvence sa poznatim proteinom. Tokom 1990-ih, pojava moćnih računara, biblioteka aminokiselinskih konformacija i polja sile razvijenih uglavnom za simulacije molekularne dinamike omogućila je razvoj alata za računarski dizajn proteina zasnovanih na strukturi. Nakon razvoja ovih računarskih alata, u posljednjih 30 godina postignut je veliki uspjeh u dizajnu proteina. Prvi protein koji je uspješno dizajniran potpuno de novo uradili su Stephen Mayo i saradnici 1997. godine, i, ubrzo nakon toga, 1999. godine Peter S. Kim i saradnici dizajnirali su dimere, trimere i tetramere neprirodnih desnorukih spiralnih zavojnica. U 2003., laboratrija Davida Bakera dizajniraja je potpuni protein do nabora kakav nikada prije nije viđen u prirodi. Kasnije, 2008. godine, Bakerova grupa je računarski dizajnirala enzime za dvije različite reakcije. In 2010, one of the most powerful broadly neutralizing antibodies was isolated from patient serum using a computationally designed protein probe. U 2024., Baker je dobio polovinu Nobelove nagrade za hemiju za svoj napredak u računarskom dizajnu proteina, dok su drugu polovinu podijelili Demis Hassabis i John Jumper iz Deepmind za predviđanje strukture proteina. Zbog ovih i drugih uspjeha (npr. pogledajte primjeri ispod), dizajn proteina postao je jedan od najvažnijih alata dostupnih za proteinsko inženjerstvo. Postoji velika nada da će dizajn novih proteina, malih i velikih, imati primjenu u biomedicini i bioinženjerstvu.

Osnovni modeli strukture i funkcije proteina

Programi za dizajn proteina koriste računarske modele molekularnih sila koje pokreću proteine u in vivo okruženjima. Da bi se problem učinio rješivim, ove sile su pojednostavljene modelima dizajna proteina. Iako se programi za dizajn proteina uveliko razlikuju, oni moraju odgovoriti na četiri glavna pitanja modeliranja: Koja je ciljna struktura dizajna, koja je fleksibilnost dozvoljena na ciljnoj strukturi, koje sekvence su uključene u pretragu i koje polje sile će se koristiti za bodovanje sekvenci i struktura.

Ciljna struktura

Protein Top7 bio je jedan od prvih proteina dizajniranih za nabor kakav nikada prije nije viđen u prirodi.

Funkcija proteina uveliko zavisi od strukture proteina, a racionalni dizajn proteina koristi ovaj odnos za dizajniranje funkcije dizajniranjem proteina koji imaju ciljnu strukturu ili nabor. Dakle, po definiciji, u racionalnom dizajnu proteina ciljna struktura ili skup struktura moraju biti unaprijed poznati. Ovo je u suprotnosti s drugim oblicima proteinskog inženjerstva, kao što je usmjerena evolucija, gdje se koristi niz metoda za pronalaženje proteina koji postižu specifičnu funkciju, i s predviđanjem strukture proteina gdje je sekvenca poznata, ali struktura nije.

Najčešće se ciljna struktura zasniva na poznatoj strukturi drugog proteina. Međutim, novi nabori koji se ne vide u prirodi postali su sve mogućiji. Peter S. Kim i saradnici dizajnirali su trimere i tetramere neprirodnih spiralnih zavojnica, koje ranije nisu viđene u prirodi. Protein Top7, razvijen u laboratoriji Davida Bakera, dizajniran je u potpunosti korištenjem algoritama za dizajn proteina, do potpuno novog oblika. Nedavno su Baker i saradnici razvili niz principa za dizajniranje idealnih globulastog proteina, struktura zasnovanih na lijevcima za savijanje proteina koji premošćuju predviđanje sekundarne i tercijarne strukture. Ovi principi, koji se temelje i na predviđanju strukture proteina i na dizajnu proteina, korišteni su za dizajniranje pet različitih novih proteinskih topologija.

Razmak sekvence

FSD-1 (prikazan plavom bojom, PDBid: 1FSV) bio je prvi de novo računarski dizajn potpunog proteina. Ciljni nabor bio je onaj cinkovog prsta u ostacima 33–60 strukture proteina Zif268 (prikazano crvenom bojom, PDB id: 1ZAA). Dizajnirana sekvenca imala je vrlo malo identičnosti sekvence sa bilo kojom poznatom proteinskom sekvencom.

U racionalnom dizajnu proteina, proteini se mogu redizajnirati iz sekvence i strukture poznatog proteina ili potpuno od nule u de novo dizajnu proteina. U redizajnu proteina, većina ostataka u sekvenci se održava kao njihova aminokiselina divljeg tipa, dok se nekolicini dozvoljava mutacija. U de novo dizajnu, cijela sekvenca se dizajnira iznova, na osnovu nepostojanja prethodne sekvence.

I de novo dizajni i redizajni proteina mogu uspostaviti pravila o prostor sekvence: specifične aminokiseline koje su dozvoljene na svakoj poziciji promjenjivog ostatka. Naprimjer, sastav površine RSC3 sonde za odabir HIV-široko neutralizirajućih antitijela bio je ograničen na osnovu evolucijskih podataka i balansiranja naboja. Mnogi od najranijih pokušaja dizajna proteina bili su u velikoj mjeri zasnovani na empirijskim pravilima o prostoru sekvenci. Štaviše, dizajn vlaknastih proteina obično slijedi stroga pravila o prostoru sekvenci. Proteini dizajnirani na bazi kolagena, naprimjer, često su sastavljeni od ponavljajućih obrazaca Gly-Pro-X. Pojava računarskih tehnika omogućava dizajniranje proteina bez ljudske intervencije u odabiru sekvenci.

Strukturna fleksibilnost

Uobičajeni programi za dizajn proteina koriste biblioteke rotamera kako bi pojednostavili konformacijski prostor bočnih lanaca proteina. Ova animacija prolazi kroz sve rotamere aminokiseline izoleucin na osnovu pretposljednje biblioteke rotamera (ukupno 7 rotamera).

U dizajnu proteina, ciljna struktura (ili strukture) proteina su poznate. Međutim, racionalan pristup dizajnu proteina mora modelirati određenu "fleksibilnost" na ciljnoj strukturi kako bi se povećao broj sekvenci koje se mogu dizajnirati za tu strukturu i kako bi se minimizirala mogućnost savijanja sekvence u drugu strukturu. Naprimjer, u redizajnu proteina jedne male aminokiseline (kao što je alanin) u čvrsto pakiranoj jezgri proteina, racionalni pristup dizajnu bi predvidio vrlo malo mutanata koji će se saviti u ciljnu strukturu, ako se okolnim bočnim lancima ne dozvoli ponovno pakiranje.

Dakle, bitan parametar svakog procesa dizajna je količina fleksibilnosti dozvoljena i za bočne lance i za okosnicu. U najjednostavnijim modelima, proteinski lanac se održava krutim, dok je nekim bočnim lancima proteina dozvoljeno da mijenjaju konformacije. Međutim, bočni lanci mogu imati mnogo stepeni slobode u dužini veza, uglovima veza i χ diedarski uglovi. Da bi se pojednostavio ovaj prostor, metode dizajna proteina koriste biblioteke rotamera koje pretpostavljaju idealne vrijednosti za dužine veza i uglove veza, dok ograničavaju χ diedarske uglove na nekoliko često uočenih niskoenergetskih konformacija nazvanih rotameri.

Biblioteke rotamera izvedene su iz statističke analize mnogih proteinskih struktura. Biblioteke rotamera nezavisne od kičme opisuju sve rotamere. Biblioteke rotamera zavisnih od glavnog lanca, nasuprot tome, opisuju rotamere kao vjerovatnoću njihovog pojavljivanja, u zavisnosti od rasporeda proteinskog glavnog oko bočnog lanca. Većina programa za dizajn proteina koristi jednu konformaciju (npr. modalnu vrijednost za rotamerne diedare u prostoru) ili nekoliko tačaka u regiji koju opisuje rotamer; program za dizajn proteina OSPREY, nasuprot tome, modelira cijelu kontinuiranu regiju.

Iako racionalni dizajn proteina mora očuvati opći nabor okosnice proteina, omogućavanje određene fleksibilnosti okosnice može značajno povećati broj sekvenci koje se savijaju u strukturu, a istovremeno održavaju opći nabor proteina. Fleksibilnost okosnice je posebno važna kod redizajna proteina jer mutacije sekvenci često rezultiraju malim promjenama u strukturi okosnice. Štaviše, fleksibilnost okosnice može biti ključna za naprednije primjene dizajna proteina, kao što su predviđanje vezivanja i dizajn enzima. Neki modeli fleksibilnosti okosnice dizajna proteina uključuju male i kontinuirane globalne pokrete okosnice, diskretne uzorke okosnice oko ciljnog nabora, pokrete trljanja unazad i fleksibilnost proteinske petlje.

Energetska funkcija

Poređenje različitih funkcija potencijalne energije. Najtačnije energetske funkcije su one koje koriste kvantno-mehaničke proračune, ali su oni previše spori za dizajn proteina. S druge strane, heurističke funkcije energije zasnivaju se na statističkim terminima i vrlo su brze. U sredini su funkcije energije molekularne mehanike koje su fizički zasnovane, ali nisu računski skupe kao kvantno-mehaničke simulacije.

Racionalne tehnike dizajna proteina moraju biti u stanju da razlikuju sekvence koje će biti stabilne pod ciljnim savijanjem od onih koje bi preferirale druga konkurentska stanja niske energije. Stoga, dizajn proteina zahtijeva tačne funkcije energije koje mogu rangirati i bodovati sekvence prema tome koliko dobro se savijaju u ciljnu strukturu. Međutim, istovremeno, ove funkcije energije moraju uzeti u obzir računske Kao izazove iza dizajna proteina. Jedan od najizazovnijih zahtjeva za uspješan dizajn je funkcija energije koja je i tačna i jednostavna za računske proračune.

Najtačnije funkcije energije su one zasnovane na kvantno-mehaničkim simulacijama. Međutim, takve simulacije su previše spore i obično nepraktične za dizajn proteina. Umjesto toga, mnogi algoritmi za dizajn proteina koriste ili energetske funkcije zasnovane na fizici prilagođene iz programa za simulaciju molekularne mehanike, funkcije zasnovane na znanju, ili hibridnu kombinaciju oba. Trend je bio ka korištenju više funkcija potencijalne energije zasnovanih na fizici.

Energetske funkcije zasnovane na fizici, kao što su AMBER i CHARMM, obično se izvode iz kvantno-mehaničkih simulacija i eksperimentalnih podataka iz termodinamike, kristalografije i spektroskopije. Ove energetske funkcije obično pojednostavljuju fizičku energetsku funkciju i čine ih parno dekompozicionim, što znači da se ukupna energija proteinske konformacije može izračunati dodavanjem parne energije između svakog para atoma, što ih čini atraktivnim za optimizacijske algoritme. Energetske funkcije zasnovane na fizici obično modeliraju privlačno-odbojni Lennard-Jonesov član između atoma i parni elektrostatski kulonovski član

Vodikove veze posredovane vodom imaju ključnu ulogu u vezivanju proteina. Jedna takva interakcija je prikazana između ostataka D457, S365 u teškom lancu HIV-široko neutralizirajućeg antitijela VRC01 (zeleno) i ostataka N58 i Y59 u proteinu omotača HIV-a GP120 (ljubičasto)

Statistički potencijali, za razliku od potencijala zasnovanih na fizici, imaju prednost brzine izračunavanja, implicitnog uzimanja u obzir složenih efekata i manje osjetljivosti na male promjene u strukturi proteina. Ove energetske funkcije su zasnovane na izvođenju energetskih vrijednosti iz učestalosti pojavljivanja u strukturnoj bazi podataka.

Međutim, dizajn proteina ima zahtjeve koji ponekad mogu biti ograničeni u poljima sila molekularne mehanike. Polja sila molekularne mehanike, koja su se uglavnom koristila u simulacijama molekularne dinamike, optimizirana su za simulaciju pojedinačnih sekvenci, ali dizajn proteina pretražuje mnoge konformacije mnogih sekvenci. Stoga, polja sila molekularne mehanike moraju biti prilagođena dizajnu proteina. U praksi, energetske funkcije dizajna proteina često uključuju i statističke i fizičke termine. Na primjer, Rosetta energetska funkcija, jedna od najčešće korištenih energetskih funkcija, uključuje fizičke energetske termine koji potiču iz CHARMM energetske funkcije i statističke energetske termine, kao što su vjerovatnoća rotamera i elektrostatika zasnovana na znanju. Tipično, energetske funkcije su visoko prilagođene između laboratorija i posebno prilagođene za svaki dizajn.

Izazovi za efikasan dizajn energetskih funkcija

Voda čini većinu molekula koji okružuju proteine i glavni je pokretač strukture proteina. Stoga je modeliranje interakcije između vode i proteina ključno u dizajnu proteina. Broj molekula vode koji u bilo kojem trenutku interaguju s proteinom je ogroman i svaki od njih ima veliki broj stepeni slobode i partnera u interakciji. Umjesto toga, programi za dizajn proteina modeliraju većinu takvih molekula vode kao kontinuum, modelirajući i hidrofobni efekat i polarizaciju solvatacije.

Pojedinačne molekule vode ponekad mogu imati ključnu strukturnu ulogu u jezgru proteina i u interakcijama protein-protein ili protein–ligand. Neuspjeh u modeliranju takvih voda može rezultirati pogrešnim predviđanjima optimalnog slijeda protein-proteinskog interfejsa. Kao alternativa, molekule vode mogu se dodati rotamerima.

Kao problem optimizacije

Ova animacija ilustruje složenost pretrage dizajna proteina, koja obično poredi sve konformacije rotamera iz svih mogućih mutacija na svim ostacima. U ovom primjeru, ostacima Phe36 i His106 je dozvoljeno da mutiraju u aminokiseline Tyr i Asn, respektivno. Phe i Tyr imaju po četiri rotamera u biblioteci rotamera, dok Asn i His imaju aedam odnosno osam rotamera, u biblioteci rotamera (iz Richardsonove pretposljednje biblioteke rotamera). Animacija prolazi kroz svih (4 + 4) x (7 + 8) = 120 mogućnosti. Prikazana struktura je struktura mioglobina,PDB id: 1mbn.

Cilj dizajna proteina je pronaći proteinsku sekvencu koja će se saviti u ciljnu strukturu. Algoritam za dizajn proteina mora, dakle, pretražiti sve konformacije svake sekvence, u odnosu na ciljni nabor, i rangirati sekvence prema konformaciji najniže energije svake od njih, kako je određeno energetskom funkcijom dizajna proteina. Dakle, tipičan ulaz u algoritam za dizajn proteina je ciljni nabor, prostor sekvence, strukturna fleksibilnost i energetska funkcija, dok je izlaz jedna ili više sekvenci za koje se predviđa da će se stabilno savijati u ciljnu strukturu.

Međutim, broj kandidatskih proteinskih sekvenci raste eksponencijalno s brojem proteinskih ostataka; na primjer, postoji 20¹⁰⁰ proteinskih sekvenci dužine 100. Nadalje, čak i ako su konformacije bočnih lanaca aminokiselina ograničene na nekoliko rotamera (vidi Strukturna fleksibilnost), to rezultira eksponencijalnim brojem konformacija za svaku sekvencu. Dakle, u našem proteinu od 100 aminokiselina, i pod pretpostavkom da svaka aminokiselina ima tačno 10 rotamera, algoritam za pretragu koji pretražuje ovaj prostor morat će pretražiti preko 200 proteinskih konformacija.

Najčešće energetske funkcije mogu se rastaviti na parne članove između rotamera i tipova aminokiselina, što problem pretvara u kombinatorni, a za njegovo rješavanje mogu se koristiti moćni optimizacijski algoritmi. U tim slučajevima, ukupna energija svake konformacije koja pripada svakoj sekvenci može se formulirati kao zbir pojedinačnih i parnih članova između pozicija ostataka. Ako je dizajner zainteresiran samo za najbolju sekvencu, algoritam za dizajn proteina zahtijeva samo konformaciju sekvence s najnižom energijom. U tim slučajevima, identitet aminokiseline svakog rotamera može se zanemariti i svi rotameri koji pripadaju različitim aminokiselinama mogu se tretirati isto. Neka je r_i rotamer na poziciji ostatka i u proteinskom lancu, a E(r_i) potencijalna energija između unutrašnjih atoma rotamera. Neka je E(r_i, r_j) potencijalna energija između r_i i rotamera r_j na poziciji ostatka j. Zatim, definiramo problem optimizacije kao pronalaženje konformacije minimalne energije (E_T

$\min E_{T}=\sum _{i}{\Big [}E_{i}(r_{i})+\sum _{i\neq j}E_{ij}(r_{i},r_{j}){\Big ]}\,$

( 1 )

Problem minimiziranja E_T je NP-težak problem. Iako je klasa problema NP-teška, u praksi se mnogi slučajevi dizajna proteina mogu riješiti tačno ili zadovoljavajuće optimizirati heurističkim metodama.

Algoritmi

Nekoliko algoritama je razvijeno posebno za problem dizajna proteina. Ovi algoritmi se mogu podijeliti u dvije široke klase: tačni algoritmi, kao što su eliminacija slijepih ulica, kojima nedostaju vrijeme izvođenja garancije, ali garantuju kvalitet rješenja; heuristički algoritmi, kao što je Monte Carlo, koji su brži od tačnih algoritama, ali nemaju garancije o optimalnosti rezultata. Tačni algoritmi garantuju da je proces optimizacije proizveo optimalno prema modelu dizajna proteina. Dakle, ako predviđanja tačnih algoritama ne uspiju kada se eksperimentalno potvrde, tada se izvor greške može pripisati energetskoj funkciji, dozvoljenoj fleksibilnosti, prostoru sekvenci ili ciljnoj strukturi (npr. ako se ne može dizajnirati za).

Neki algoritmi za dizajn proteina navedeni su u nastavku. Iako se ovi algoritmi bave samo najosnovnijom formulacijom problema dizajna proteina, Jednačinom (1  ), kada se cilj optimizacije promijeni jer dizajneri uvode poboljšanja i proširenja modela dizajna proteina, kao što su poboljšanja dozvoljene strukturne fleksibilnosti (npr. fleksibilnost proteinskog skeleta) ili uključivanje sofisticiranih energetskih termina, mnoga proširenja dizajna proteina koja poboljšavaju modeliranje izgrađena su na ovim algoritmima. Na primjer, Rosetta Design uključuje sofisticirane energetske termine i fleksibilnost skeleta koristeći Monte Carlo kao osnovni optimizacijski algoritam. OSPREY-jevi algoritmi grade se na algoritmu eliminacije slijepih ulica i A* kako bi uključili kontinuirane pokrete skeleta i bočnih lanaca. Dakle, ovi algoritmi pružaju dobru perspektivu o različitim vrstama algoritama dostupnih za dizajn proteina. U 2020., naučnici su izvijestili o razvoju procesa zasnovsnog na vještačkoj inteligenciji, koristeći genomske baze podataka za bazirano na evoluciji dizajniranje novih proteina. Koristili su duboko učenje za identifikaciju pravila dizajna. U 2022., studija je izvijestila o softveru za duboko učenje koji može dizajnirati proteine koji sadrže unaprijed specificirana funkcionalna mjesta.

Sa matematičkim garancijama

Eliminacija slijepog ulice

Šablon:Flavni Algoritam eliminacije slijepe ulice (DEE) iterativno smanjuje prostor pretraživanja problema uklanjanjem rotamera za koje se može dokazati da nisu dio globalne konformacije najniže energije (GMEC). U svakoj iteraciji, algoritam eliminacije slijepe ulice uspoređuje sve moguće parove rotamera na svakoj poziciji ostatka i uklanja svaki rotamer rε_i za koji se može pokazati da uvijek ima veću energiju od drugog rotamera r_i i stoga nije dio GMEC-a:

$E(r_{i}^{\prime })+\sum _{j\neq i}\min _{r_{j}}E(r_{i}^{\prime },r_{j})>E(r_{i})+\sum _{j\neq i}\max _{r_{j}}E(r_{i},r_{j})$

Pszala moćna proširenja algoritma za eliminaciju slijepe ulice uključuju kriterij eliminacije parova i generalizirani kriterij eliminacije slijepe ulice. Ovaj algoritam je također proširen za rukovanje kontinuiranim rotamerima s dokazivim garancijama.

Iako se algoritam za eliminaciju slijepe ulice izvršava u polinomijalnom vremenu na svakoj iteraciji, ne može garantirati konvergenciju. Ako, nakon određenog broja iteracija, algoritam za eliminaciju slijepe ulice ne ukloni više rotamera, tada se rotameri moraju spojiti ili se mora koristiti drugi algoritam pretraživanja za pretraživanje preostalog prostora pretraživanja. U takvim slučajevima, eliminacija slijepe ulice djeluje kao algoritam za prethodno filtriranje kako bi se smanjio prostor pretrage, dok se drugi algoritmi, poput A*, Monte Carlo, linearnog programiranja ili FASTER, koriste za pretraživanje preostalog prostora pretrage.

Grana i granica

Glavni članak: Grana i granica

Konformacijski prostor dizajna proteina može se predstaviti kao stablo, gdje su proteinski ostaci poredani na proizvoljan način, a stablo se grana na svakom od rotamera u ostatku. Algoritmi grana i granica koriste ovaj prikaz za efikasno istraživanje konformacijskog stabla: Na svakom grananju, algoritmi grananja i granica ograničavaju konformacijski prostor i istražuju samo obećavajuće grane.

Popularan algoritam pretraživanja za dizajn proteina je A* algoritam pretraživanja. A* izračunava rezultat donje granice na svakoj parcijalnoj putanji stabla koja određuje donje granice (uz garancije) energije svakog od proširenih rotamera. Svaka parcijalna konformacija se dodaje u red prioriteta i u svakoj iteraciji parcijalni put s najnižom donjom granicom se izvlači iz reda i proširuje. Algoritam se zaustavlja kada se nabroji puna konformacija i garantuje da je konformacija optimalna. A* rezultat f u dizajnu proteina sastoji se od dva dijela, f=g+h. g je tačna energija rotamera koji su već dodijeljeni u parcijalnoj konformaciji. h je donja granica energije rotamera koji još nisu dodijeljeni. Svaki je dizajniran na sljedeći način, gdje je d indeks posljednjeg dodijeljenog ostatka u parcijalnoj konformaciji.

$g=\sum _{i=1}^{d}(E(r_{i})+\sum _{j=i+1}^{d}E(r_{i},r_{j}))$

$h=\sum _{j=d+1}^{n}[\min _{r_{j}}(E(r_{j})+\sum _{i=1}^{d}E(r_{i},r_{j})+\sum _{k=j+1}^{n}\min _{r_{k}}E(r_{j},r_{k}))]$

Linearno programiranje cjelobrojnih brojeva

Glavni članci: Linearno programiranje § Cjelobrojne nepoznanice, i Cjelobrojno programiranje

Problem optimizacije E_T (Jednačina (1  )) može se lako formulirati kao linearni program cjelobrojnih brojeva (ILP). Jedna od najmoćnijih formulacija koristi binarne varijable za predstavljanje prisutnosti rotamera i rubova u konačnom rješenju i ograničava rješenje da ima tačno jedan rotamer za svaki ostatak i jednu parnu interakciju za svaki par ostataka:

$\ \min \sum _{i}\sum _{r_{i}}E_{i}(r_{i})q_{i}(r_{i})+\sum _{j\neq i}\sum _{r_{j}}E_{ij}(r_{i},r_{j})q_{ij}(r_{i},r_{j})\,$

s.t.

$\sum _{r_{i}}q_{i}(r_{i})=1,\ \forall i$

$\sum _{r_{j}}q_{ij}(r_{i},r_{j})=q_{i}(r_{i}),\forall i,r_{i},j$

$q_{i},q_{ij}\in \{0,1\}$

ILP rješavači, kao što je CPLEX, mogu izračunati tačno optimalno rješenje za velike instance problema dizajna proteina. Ovi rješavači koriste linearnu programsku relaksaciju problema, gdje je q_i i q_ij dozvoljeno da uzimaju kontinuirane vrijednosti, u kombinaciji s algoritmom grananje i rezanje za pretraživanje samo malog dijela konformacionog prostora za optimalno rješenje. Pokazalo se da ILP rješavači rješavaju mnoge instance problema postavljanja bočnog lanca.

Aproksimacije zasnovane na prenosu poruka za linearno programiranje dualno

ILP rješavači zavise od algoritama linearnog programiranja (LP), kao što su metode zasnovane na Simplex ili barijeri za izvođenje LP relaksacije na svakoj grani. Ovi LP algoritmi su razvijeni kao metode optimizacije opšte namjene i nisu optimizovani za problem dizajna proteina (Jednačina (1  )). Posljedično, LP relaksacija postaje usko grlo ILP rješavača kada je veličina problema velika. Nedavno je dizajnirano nekoliko alternativa zasnovanih na algoritmima za prenošenje poruka posebno za optimizaciju LP relaksacije problema dizajna proteina. Ovi algoritmi mogu aproksimirati i instance cjelobrojnog programiranja dualnih ili primal cjelobrojnog programiranja, ali kako bi se održale garancije optimalnosti, najkorisniji su kada se koriste za aproksimaciju dualnia problema dizajna proteina, jer aproksimacija duala garantuje da se ne propuštaju rješenja. Aproksimacije zasnovane na prenošenju poruka uključuju algoritam prenošenja poruka s maksimalnim proizvodom s ponderima stabla i algoritam linearnog programiranja prenošenja poruka.

Algoritmi optimizacije bez garancija

Monte Carlo i simulirano kaljenje

Monte Carlo je jedan od najčešće korištenih algoritama za dizajn proteina. U svom najjednostavnijem obliku, Monte Carlo algoritam nasumično bira ostatak, a u tom ostatku se procjenjuje nasumično odabrani rotamer (bilo koje aminokiseline). Nova energija proteina, E_new, poredi se sa starom energijom E_old i novi rotamer se prihvata sa vjerovatnoćom:

$p=e^{-\beta (E_{\text{new}}-E_{\text{old}}))},$

gdje je β Boltzmannova konstanta, a temperatura T može se odabrati, tako da u početnim rundama bude visoka i da se polhako žari kako bi se prevazišli lokalni minimumi.

FASTER

Algoritam FASTER koristi kombinaciju determinističkih i stohastičkih kriterija za optimizaciju sekvenci aminokiselina. FASTER prvo koristi DEE kako bi eliminirao rotamere koji nisu dio optimalnog rješenja. Zatim, niz iterativnih koraka optimizira dodjeljivanje rotamera..

Propagacija vjerovanja

U propagaciji vjerovanja za dizajn proteina, algoritam razmjenjuje poruke koje opisuju uvjerenje koje svaki ostatak ima o vjerovatnoći svakog rotamera u susjednim ostacima. Algoritam ažurira poruke na svakoj iteraciji i iterira do konvergencije ili do fiksnog broja iteracija. Konvergencija nije zagarantovana u dizajnu proteina. Poruka m_{i→ j}(r_j koju ostatak i šalje svakom rotameru (r_j na susjednom ostatku j definirana je kao:

$m_{i\to j}(r_{j})=\max _{r_{i}}{\Big (}e^{\frac {-E_{i}(r_{i})-E_{ij}(r_{i},r_{j})}{T}}{\Big )}\prod _{k\in N(i)\backslash j}m_{k\to i(r_{i})}$

I propagacija vjerovanja na osnovu maksimalnog proizvoda i na osnovu sume proizvoda korištena je za optimizaciju dizajna proteina.

Primjene i primjeri dizajniranih proteina

Dizajn enzima

Dizajn novih enzima je upotreba dizajna proteina sa ogromnim bioinženjerskim i biomedicinskim primjenama. Općenito, dizajniranje proteinske strukture može se razlikovati od dizajniranja enzima, jer dizajn enzima mora uzeti u obzir mnoga stanja uključena u katalitski mehanizam enzima. Međutim, dizajn proteina je preduvjet dizajna enzima de novo jer, u najmanju ruku, dizajn katalizatora zahtijeva skelu u koju se može umetnuti katalitski mehanizam.

Veliki napredak u dizajnu i redizajnu enzima „de novo“ postignut je u prvoj deceniji 21. vijeka. U tri velike studije, David Baker i saradnici „de novo“ su dizajnirali enzime za retro-aldolnu reakciju, Kemp-eliminacijsku reakciju, i za Diels-Alderovu reakcijua. Također, u laboratoriji Brucea Donalda, korišten je računarski dizajn proteina za promjenu specifičnosti jednog od proteinskih domena neribosomalne peptidne sintetaze koji proizvodi Gramicidin S, sa njegovog prirodnog supstrata fenilalanina na druge nesrodne supstrate, uključujući nabijene aminokiseline; redizajnirani enzimi imali su aktivnosti bliske onima divljeg tipa.

Poluracionalni dizajn

Poluracionalni dizajn je svrsishodna metoda modifikacije zasnovana na određenom razumijevanju sekvence, strukture i katalitičkog mehanizma enzima. Ova metoda se nalazi između iracionalnog i racionalnog dizajna. Koristi poznate informacije i sredstva za izvođenje evolucijske modifikacije specifične funkcije ciljnog enzima. Karakteristika poluracionalnog dizajna je da se ne oslanja isključivo na slučajne mutacije i skrining, već kombinuje koncept usmjerene evolucije. Stvara biblioteku slučajnih mutanata sa različitim sekvencama putem mutageneze, RCR-a sklonpg greškama, rekombinacije DNK i mutageneze zasićenja mjesta. Istovremeno, koristi razumijevanje enzima i principa dizajna kako bi svrsishodno isključio mutante sa željenim karakteristikama.

Metodologija poluracionalnog dizajna naglašava dubinsko razumijevanje enzima i kontrolu evolucijskog procesa. Omogućava istraživačima da koriste poznate informacije za vođenje evolucijskog procesa, čime se poboljšava efikasnost i stopa uspjeha. Ova metoda igra važnu ulogu u modifikaciji funkcije proteina jer može kombinovati prednosti iracionalnog i racionalnog dizajna, te može istraživati nepoznati prostor i koristiti poznato znanje za ciljanu modifikaciju.

Poluracionalni dizajn ima širok spektar primjena, uključujući, ali ne ograničavajući se na optimizaciju enzima, modifikaciju ciljeva lijekova, evoluciju biokatalizatora itd. Pomoću ove metode, istraživači mogu efikasnije poboljšati funkcionalna svojstva proteina kako bi zadovoljili specifične biotehnološke ili medicinske potrebe. Iako ova metoda ima visoke zahtjeve za informacijama i tehnologijom i relativno ju je teško implementirati, s razvojem računarske tehnologije i bioinformatike, izgledi primjene poluracionalnog dizajna u proteinskom inženjerstvu postaju sve širi.

Dizajn za afinitet

Interakcije proteina-protein uključene su u većinu biotičkih procesa. Mnoge od najteže liječivih bolesti, poput Alzheimerove bolesti, mnogih oblika raka (npr. TP53) i infekcije virusa ljudske imunodeficijencije , uključuju interakcije protein-protein. Stoga je za liječenje takvih bolesti poželjno dizajnirati proteine ili terapiju sličnu proteinima koja se veže za jednog od partnera u interakciji i na taj način prekida interakciju koja uzrokuje bolest. To zahtijeva dizajniranje proteinske terapije za afinitet prema svom partneru.

Interakcije proteina-protein mogu se dizajnirati korištenjem algoritama za dizajn proteina jer principi koji upravljaju stabilnošću proteina također upravljaju vezivanjem proteina i proteina. Međutim, dizajn interakcije protein-protein predstavlja izazove koji nisu obično prisutni u dizajnu proteina. Jedan od najvažnijih izazova je taj što su, općenito, interfejsi između proteina polarniji od proteinskih jezgara, a vezivanje uključuje kompromis između desolvatacije i formiranja vodikove veze. Da bi prevazišli ovaj izazov, Bruce Tidor i saradnici razvili su metodu za poboljšanje afiniteta antitijela fokusirajući se na elektrostatičke doprinose. Otkrili su da je, za antitijela dizajnirana u studiji, smanjenje troškova desolvatacije ostataka u međupovršini povećalo afinitet vezivnog para.

Ocjenjivanje predviđanja vezivanja

Energetske funkcije dizajna proteina moraju se prilagoditi za bodovanje predviđanja vezivanja jer vezivanje uključuje kompromis između najnižih -energija konformacija slobodnih proteina (E_P i E_L) i najniže energetske konformacije vezanog kompleksa (E_PL):

$\Delta _{G}=E_{PL}-E_{P}-E_{L}$.+

K* algoritam aproksimira konstantu vezivanja algoritma uključivanjem konformacijske entropije u izračun slobodne energije. K* algoritam uzima u obzir samo konformacije najniže energije slobodnih i vezanih kompleksa (označenih skupovima P, L i PL) kako bi aproksimirao particijske funkcije svakog kompleksa:

$K^{*}={\frac {\sum \limits _{x\in PL}e^{-E(x)/RT}}{\sum \limits _{x\in P}e^{-E(x)/RT}\sum \limits _{x\in L}e^{-E(x)/RT}}}$

Dizajn za specifičnost

Dizajn interakcija protein-protein mora biti vrlo specifičan jer proteini mogu interreagovati s velikim brojem proteina; uspješan dizajn zahtijeva selektivne vezivne supstance. Stoga, algoritmi za dizajn proteina moraju biti u stanju razlikovati vezivanje na meti (ili pozitivni dizajn) i vezivanje van mete (ili negativni dizajn). Jedan od najistaknutijih primjera dizajna za specifičnost je dizajn specifičnih peptida koji se vežu za bZIP od strane Amy Keating i saradnika za 19 od 20 bZIP porodica; osam od ovih peptida bilo je specifično za svog namjeravanog partnera u odnosu na konkurentske peptide. Nadalje, Anderson i saradnici su također koristili pozitivan i negativan dizajn za predviđanje mutacija u aktivnom mjestu cilja lijeka koje su uzrokovale otpornost na novi lijek; pozitivni dizajn je korišten za održavanje aktivnosti divljeg tipa, dok je negativni dizajn korišten za prekid vezivanja lijeka. Nedavni računarski redizajn koji su odradili Costas Maranas i saradnici također je omogućio eksperimentalno prebacivanje specifičnosti ksiloza reduktaze (kofaktor Candida boidinii sa NADPH na NADH.

Obnavljanje površine proteina

Obnavljanje površine proteina sastoji se od dizajniranja površine proteina uz očuvanje cjelokupnog nabora, jezgra i graničnih područja proteina netaknutim. Obnavljanje površine proteina je posebno korisno za promjenu vezivanja proteina za druge proteine. Jedna od najvažnijih primjena obnavljanja površine proteina bio je dizajn RSC3 sonde za odabir široko neutralizirajućih antitijela protiv HIV-a u Istraživačkom centru za vakcine NIH. Prvo su odabrani ostaci izvan vezivnog interfejsa između proteina omotača HIV-a gp120 i ranije otkrivenog b12-antitijela za dizajniranje. Zatim je razmak sekvenci odabran na osnovu evolucijskih informacija, topljivosti, sličnosti s divljim tipom i drugih razmatranja. Zatim je korišten softver RosettaDesign za pronalaženje optimalnih sekvenci u odabranom prostoru sekvenci. RSC3 je kasnije korišten za otkrivanje široko neutralizirajućeg antitijela VRC01 u serumu dugotrajno HIV-inficirane osobe bez progresije.

Dizajn globulastih proteina

Globulaati proteini su proteini koji sadrže hidrofobno jezgro i hidrofilnu površinu. Globulasti proteini često imaju stabilnu strukturu, za razliku od vlaknastih proteina, koji imaju višestruke konformacije. Trodimenzijsku strukturu globulastih proteina obično je lakše odrediti putem rendgenske kristalografije i nuklearne magnetne rezonance nego vlaknastih i membranskih proteina, što globulaste proteine čini atraktivnijim za dizajn proteina od drugih vrsta proteina. Većina uspješnih dizajna proteina uključivala je globularne proteine. I RSD-1 i Top7 bili su de novo dizajni globulaatstih proteina. Još pet proteinskih struktura dizajnirano je, sintetizirano i verificirano 2012. godine od strane Bakerpve grupe. Ovi novi proteini nemaju biotičku funkciju, ali su strukture namijenjene da djeluju kao gradivni blokovi koji se mogu proširiti kako bi uključili funkcionalna aktivna mjesta. Strukture su pronađene računarski korištenjem novih heuristika zasnovanih na analizi povezujućih petlji između dijelova sekvence koje specificiraju sekundarne strukture..

Dizajn membranskih proteina

Nekoliko transmembranskih proteina je uspješno dizajnirano, along with many other membrane-associated peptides and proteins. Recently, Costas Maranas and his coworkers developed an automated tool to redesign the pore size of Outer Membrane Porin Type-F (OmpF) from E.coli to any desired sub-nm size and assembled them in membranes to perform precise angstrom scale separation.

Ostale primjene

Jedna od najpoželjnijih upotreba za dizajn proteina su biosenzori, proteini koji će osjetiti prisustvo specifičnih spojeva. Neki pokušaji u dizajnu biosenzora uključuju senzore za neprirodne molekule, uključujući TNT. Nedavno su Kuhlman i saradnici dizajnirali biosenzor PAK1.

U određenom smislu, dizajn proteina je podskup dizajna baterije.

Također pogledajte

• Proteinsko omženjerstvo
• Softver za molekularni dizajn
  • Poređenje softvera za modeliranje molekularne mehanike
  • Softver za predviđanje strukture proteina
• Sintetska biologija

Dodatni izvori

• Donald, Bruce R. (2011). Algorithms in Structural Molecular Biology. Computational Molecular Biology. Cambridge, Mass.: The MIT Press. ISBN 9780262015592. OCLC 1200909148.
• Jin, Wenzhen; Kambara, Ohki; Sasakawa, Hiroaki; Tamura, Atsuo & Takada, Shoji (maj 2003). "De Novo Design of Foldable Proteins with Smooth Folding Funnel: Automated Negative Design and Experimental Verification". Structure. 11 (5): 581–590. doi:10.1016/S0969-2126(03)00075-3. PMID 12737823.
• Pokala, Navin & Handel, Tracy M. (2005). "Energy Functions for Protein Design: Adjustment with Protein–Protein Complex Affinities, Models for the Unfolded State, and Negative Design of Solubility and Specificity". Journal of Molecular Biology. 347 (1): 203–227. doi:10.1016/j.jmb.2004.12.019. PMID 15733929.
• Sander, Chris; Vriend, Gerrit; Bazan, Fernando; Horovitz, Amnon; Nakamura, Haruki; Ribas, Luis; Finkelstein, Alexei V.; Lockhart, Andrew; Merkl, Rainer; et al. (februar 1992). "Protein Design on Computers. Five New Proteins: Shpilka, Grendel, Fingerclasp, Leather and Aida". Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 12 (2): 105–110. doi:10.1002/prot.340120203. PMID 1603799. S2CID 38986245.