Idi na sadržaj

Genetički skrining

Nepregledano
S Wikipedije, slobodne enciklopedije
1♂︎—Sperma se prikuplja od muškarca.
1♀︎—Jajne ćelije se prikupljaju od ženke tankom iglom koja se prolazi kroz vaginu ili kroz abdomen pod ultrazvučnim nadzorom [transvaginskaa ili transabdomenska ultrazvučna aspiracija].
2a—Sperma i jajne ćelije se oplođuju.
2b—Rezultirajući embrioni se čuvaju na sigurnom i prate se kako bi se vidjelo koji će napredovati.
3a—Embrionima se dozvoljava da se razvijaju; Oni koji napreduju dobijaju identifikatore.
3b—Genetski test se provodi na svakom embrionu za datu osobinu, a rezultati se upoređuju sa embrionima.
4—Embrioni bez željene osobine se identificiraju i odbacuju.
5—Preostalim embrionima se dozvoljava da rastu do te mjere da se mogu implantirati.
6a—Embrioni sa željenom osobinom se implantiraju.
6b—Embrioni rezultiraju zdravom trudnoćom.
6c—Rađaju se dvojajni blizanci sa željenom osobinom, koja nije izražena kod njihove majke.

Pregled

[uredi | uredi izvor]

Preimplantacijska genetička dijagnoza (PGD ili PIGD) je genetičko profiliranje embriona prije implantacija (kao oblik profiliranja embrija),[1] a ponekad čak i oocita prije oplodnje. PGD se razmatra na sličan način kao i prenatalna dijagnoza. Kada se koristi za skrining specifične genetske bolesti, njena glavna prednost je što izbjegava selektivni pobačaj, jer metod čini vrlo vjerovatnim da će beba biti bez bolesti o kojoj se raspravlja. PGD je stoga dodatak potpomognutoj reproduktivnoj tehnologiji i zahtijeva in vitro oplodnju (IVF) za dobijanje oocita ili embriona za procjenu. Embrioni se obično dobijaju putem blastomera ili biopsijom blastocita. Potonja tehnika se pokazala manje štetnom za embrion, stoga je preporučljivo izvršiti biopsiju oko 5. ili 6. dana razvoja.[2]

Genetički skrining ili skrining mutageneze je eksperimentalna tehnika koja se koristi za identifikaciju i odabir jedinki koje posjeduju fenotip od interesa u mutageniziranoj populaciji.[3] Stoga je genetički skrining tip fenotipskog skrininga. Genetički skrining može pružiti važne informacije o funkciji gena, kao i o molekularnim događajima koji su u osnovi biološkog procesa ili puta. Iako su genomski projekti identificirali opsežan inventar gena u mnogim različitim organizmima, genetički skrining može pružiti vrijedan uvid u to kako ti geni funkcioniraju.[4][5][6][7][8]

Osnovni skrining

[uredi | uredi izvor]

Napredna genetika (napredni genetički skrining) počinje s fenotipom, a zatim pokušava identificirati uzročnu mutaciju i time gen(e) odgovorne za fenotip. Naprimjer, poznati eksperti za skrining Christiane Nüsslein-Volhard i Eric Wieschaus mutagenizirli su vinske mušice, a zatim krenuli u pronalaženje gena koji uzrokuju uočene mutantne fenotipove.[9]

Uspješni genetički skrining unaprijed često zahtijeva definiranu genetičku pozadinu i jednostavan eksperimentalni postupak. To jest, kada se više jedinki mutagenizira, one bi trebale biti genetički identične kako bi i njihov fenotip divljeg tipa bio identičan, a mutantni fenotipovi se lakše identificiraju. Jednostavan metod skrininga omogućava skrining većeg broja jedinki, čime se povećava vjerovatnoća generiranja i identifikacije mutanata od interesa.[5]

Budući da su prirodne alelne mutacije rijetke prije skrininga, genetičari često mutageniziraju populaciju jedinki izlažući ih poznatom mutagenu, kao što je hemikalija ili zračenje, čime se generira mnogo veća učestalost hromosomskih mutacija.[3] Kod nekih organizama se mutageni koriste za izvođenje skrininga zasićenja, odnosno skrininga koji se koristi za otkrivanje svih gena uključenih u određeni fenotip. Christiane Nüsslein-Volhard i Eric Wieschaus bili su prvi pojedinci koji su proveli ovaj tip skrining postupka na životinjama.[10]

Obratna genetika (ili obrnuti genetički skrining), počinje s poznatim genom i ispituje učinak njegovog poremećaja analizom rezultirajućih fenotipova. Naprimjer, u nokaut-skriningu, jedan ili više gena se potpuno brišu, a mutanti delecija se testiraju na fenotipove. Takvi skrininzi su urađeni za sve gene kod mnogih bakterija, pa čak i složenih organizama, kao što je C. elegans.[3] Obrnuti genetićki skrining obično počinje sekvencom gena nakon čega slijedi ciljana inaktivacija.[11] Štaviše, indukuje mutacije u modelnim organizmima kako bi se saznala njihova uloga u bolesti.[12] Obratna genetika se također koristi za pružanje izuzetno tačne statistike o mutacijama koje se javljaju u određenim genima. Iz ovih analiza možete utvrditi koliko su mutacije slučajne i koliko često se javljaju.[13]

Varijacije skrininga

[uredi | uredi izvor]

Mnoge varijacije skrininga su osmišljene kako bi se razjasnio gen koji dovodi do mutantnog fenotipa od interesa.

Pojačivač

[uredi | uredi izvor]

Skrining pojačivača počinje s mutantom koji ima zahvaćen proces od interesa poznatom genskom mutacijom. Skrining se zatim može koristiti za identifikaciju dodatnih gena ili genskih mutacija koje igraju ulogu u tom biološkom ili fiziološkom procesu. Skrining genetičkog pojačivača identificira mutacije koje pojačavaju fenotip od interesa kod već mutirane jedinke. Fenotip dvostrukog mutanta (jedinke s pojačivačem i originalnom pozadinskom mutacijom) je istaknutiji od bilo kojeg od pojedinačnih mutantnih fenotipova. Pojačanje mora premašiti očekivane fenotipove dvije mutacije same za sebe, te se stoga svaka mutacija može smatrati pojačivačem druge. Izoliranje mutanata pojačivača može dovesti do identifikacije gena koji međusobno djeluju ili gena koji djeluju redundantno jedan u odnosu na drugog.[14]

Supresor

[uredi | uredi izvor]

Supresorski skrining se koristi za identifikaciju supresorskih mutacija koje ublažavaju ili vraćaju fenotip originalne mutacije, u procesu definisanom kao sintetska vijabilnost.[15] Supresorske mutacije mogu se opisati kao druge mutacije na mjestu na hromozomu različitom od mutacije koja se proučava, koje potiskuju fenotip originalne mutacije.[16] Ako se mutacija nalazi u istom genu kao i originalna mutacija, poznata je kao intragenska supresija, dok se mutacija smještena u drugom genu naziva ekstragenska supresija ili intergenska supresija.[3] Supresorske mutacije su izuzetno korisne za definiranje funkcija biohemijskih puteva unutar ćelije i odnosa između različitih biohemijskih puteva.

Osjetljivost na temperaturu

[uredi | uredi izvor]

Temperaturno osjetljivi skrining uključuje izvođenje temperaturnih promjena kako bi se pojačao mutirani fenotip. Populacija uzgajana na niskim temperaturama imala bi normalan fenotip; međutim, mutacija u određenom genu učinila bi je nestabilnom na višoj temperaturi. Naprimjer, skrining za temperaturnu osjetljivost kod vinskih mušica može uključivati podizanje temperature u kavezu dok neke mušice ne klonu, a zatim otvaranje portala kako bi ostale mogle pobjeći. Jedinke odabrane u skriningu sklone su nositi neobičnu verziju gena uključenog u fenotip od interesa. Prednost alela pronađenih u ovoj vrsti skrininga je ta što je mutantni fenotip uvjetovan i može se aktivirati jednostavnim podizanjem temperature. Nulti mutantni skrining u takvom genu može biti smrtonosan za embrion i takvi mutanti bi bili propušteni u osnovnom skriningu. Poznati temperaturno osjetljivi skrining su nezavisno proveli Lee Hartwell i Paul Nurse , kako bi identificirali mutante s defektima u ćelijskom ciklusu kod S. cerevisiae, odnosno S. pombe.

RNKi

[uredi | uredi izvor]
Pregled metode embrionalne injekcije RNK interferencije (RNAi)

Skrining RNKi je u suštini direktan genetički skrining korištenjem tehnike reverzne genetike. Slično klasičnim genetičkim skriningima u prošlosti, uspjeh velikih RNAi istraživanja zavisi od pažljivog razvoja fenotipskih testova i njihove interpretacije. Kod Drosophila, RNKi je primijenjena u kultivisanim ćelijama ili in vivo za istraživanje genskih funkcija i za uticaj na funkciju pojedinačnih gena na nivou cijelog genoma. RNKi se koristi za utišavanje genske ekspresije kod Drosophila ubrizgavanjem dsRNK u rane embrione i interferencijom sa kovrdžavost i kovrdžav2 genima stvarajući defekte u embrionskom obrascu koji oponašaju gubitak funkcije bez krila.[17]

CRISPR

[uredi | uredi izvor]
Cas12a u kompleksu sa crRNK i ciljnom DNK – ključni alat za CRISPR skrining

CRISPR/Cas se prvenstveno koristi za reverzne genetičke skrininge. CRISPR ima sposobnost kreinja biblioteka hiljada preciznih genetičkih mutacija i može identificirati nove tumore, kao i validirati starije tumore u istraživanju raka. Biblioteka CRISPR-Cas9 nokaut na nivou genoma (GeCKO) koja cilja 18.080 gena sa 64.751 jedinstvenim vodičem sekvenci identificira gene bitne za održivost ćelija kod raka. Bakterijski CRISPR–Cas9 sistem za inženjestvo mutacija gubitka funkcije (LOF) i dobitka funkcije (GOF) u netransformisanim ljudskim crijevnim organoidima kako bi se demonstrirao model kolorektumskog karcinoma (CRC). Također se može koristiti za proučavanje funkcionalnih posljedica mutacija in vivo omogućavanjem direktnog uređivanja genoma u somatskim ćelijama.[12]

Mapiranje mutanata

[uredi | uredi izvor]

Pristupom klasične genetike, istraživač bi zatim locirao (mapirao) gen na njegovom hromozomu putem ukrštanja sa jedinkama koje nose druge neobične biološk osobine i prikupljanjem statistike o tome koliko se često te dvije osobine nasljeđuju zajedno. Klasični genetičari bi koristili fenotipske osobine za mapiranje novih mutiranih alela. Pojavom genomskih sekvenci za modelne sisteme kao što su Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana i C. elegans sada je identificirano mnogo jednonukleotidnih polimorfizama (SNP-ova) koji se mogu koristiti kao osobine za mapiranje. U stvari, Heidelbergov skrining, koji je omogućavao masovno testiranje mutanata, a koji su 1980. razvili Nüsslein-Volhard i Wieschaus, utro je put budućim naučnicima u ovoj oblasti.[6] SNP-ovi su preferirane osobine za mapiranje jer su vrlo česti, reda veličine jedne razlike na 1000 baznih parova, između različitih vrsta organizama. Mutageni poput nasumičnih umetanja DNK putem transformacija ili aktivnih transpozabilnih elemenata također se mogu koristiti za generiranje novih mutanata. Ove tehnike imaju prednost označavanja novih alela poznatim molekularnim (DNK) markerom koji može olakšati brzu identifikaciju gena.[10]

Pozicijsko kloniranje

[uredi | uredi izvor]

Pozicijsko kloniranje je metoda identifikacije gena u kojoj se gen za određeni fenotip identificira samo približnom lokacijom na hromosomu (ali ne i funkcijom); ovo je poznato kao regija kandidata. U početku se regija kandidat može definirati korištenjem tehnika kao što je analiza povezanosti, a zatim se koristi pozicijsko kloniranje za sužavanje regije kandidata dok se ne pronađu gen i njegove mutacije. Pozicijsko kloniranje obično uključuje izolaciju djelomično preklapajućih segmenata DNK iz genomskih biblioteka kako bi se napredovalo duž hromosoma prema određenom genu. Tokom pozicijskog kloniranja, potrebno je utvrditi da li je segment DNK koji se trenutno razmatra dio gena.

Testovi koji se koriste u ovu svrhu uključuju hibridizaciju među vrstama, identifikaciju nemetiliranih CpG ostrva, hvatanje egzona, direktnu selekciju cDNK, kompjutersku analizu DNK sekvence, skrining mutacija kod pogođenih osoba i testove ekspresija gena. Za genome u kojima su regije genetičkih polimorfizama poznate, pozicijsko kloniranje uključuje identifikaciju polimorfizama koji okružuju mutaciju. Ovaj proces zahtijeva da se fragmenti DNK iz najbližeg poznatog genetskog markera progresivno kloniraju i sekvenciraju, približavajući se mutantnom alelu sa svakim novim klonom. Ovaj proces proizvodi mapu kontigenata lokusa i poznat je kao hodanje hromosoma. Sa završetkom projekata sekvenciranja genoma kao što je Projekt ljudskog genoma, moderno pozicijsko kloniranje može direktno koristiti gotove kontigente iz baza podataka sekvenci genoma.

Za svaki novi DNK-klon, polimorfizam se identificira i testira u populaciji za mapiranje na njegovu rekombinacija učestalost u poređenju s mutantnim fenotipom. Kada je DNK klon na ili blizu mutantnog alela, učestalost rekombinacije trebala bi biti blizu nule. Ako hromozomski hod prolazi kroz mutirani alel, novi polimorfizmi će početi pokazivati povećanje učestalosti rekombinacije u poređenju s mutantnim fenotipom. Ovisno o veličini populacije za mapiranje, mutirani alel može se suziti na malu regiju (<30 Kb). Poređenje sekvenci između divljeg tipa i mutantne DNK u toj regiji je tada potrebno kako bi se locirala DNK mutacija koja uzrokuje fenotipsku razliku.

Moderno pozicijsko kloniranje može direktnije izvući informacije iz projekata genomskog sekvenciranja i postojećih podataka.

Reference

[uredi | uredi izvor]
  1. ↑ "PGD / PGS – A boon for couples with genetic issues – Times of India". The Times of India. 31. 5. 2019.
  2. ↑ Sullivan-Pyke C, Dokras A (mart 2018). "Preimplantation Genetic Screening and Preimplantation Genetic Diagnosis". Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 45 (1): 113–125. doi:10.1016/j.ogc.2017.10.009. PMID 29428279.
  3. 1 2 3 4 Hartwell LH, Hood L, Goldberg ML, Reynolds AE, Silver LM, Veres RC (2008). Genetics: from genes to genomes. Boston: McGraw-Hill Higher Education. ISBN 978-0-07-284846-5.
  4. ↑ Patton EE, Zon LI (decembar 2001). "The art and design of genetic screens: zebrafish". Nature Reviews. Genetics. 2 (12): 956–966. doi:10.1038/35103567. PMID 11733748. S2CID 3166016.
  5. 1 2 Page DR, Grossniklaus U (februar 2002). "The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana". Nature Reviews. Genetics. 3 (2): 124–136. doi:10.1038/nrg730. PMID 11836506. S2CID 431110.
  6. 1 2 St Johnston D (mart 2002). "The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster". Nature Reviews. Genetics. 3 (3): 176–188. doi:10.1038/nrg751. PMID 11972155. S2CID 195368351.
  7. ↑ Jorgensen EM, Mango SE (maj 2002). "The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans". Nature Reviews. Genetics. 3 (5): 356–369. doi:10.1038/nrg794. PMID 11988761. S2CID 152517.
  8. ↑ Casselton L, Zolan M (septembar 2002). "The art and design of genetic screens: filamentous fungi". Nature Reviews. Genetics. 3 (9): 683–697. doi:10.1038/nrg889. PMID 12209143. S2CID 11744977.
  9. ↑ Nüsslein-Volhard C, Wieschaus E (oktobar 1980). "Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila". Nature. 287 (5785): 795–801. Bibcode:1980Natur.287..795N. doi:10.1038/287795a0. PMID 6776413. S2CID 4337658.
  10. 1 2 "Genetic Screen". Stem Cells Research. Arhivirano s originala, 1. 4. 2012. Pristupljeno 3. 5. 2012.
  11. ↑ Boutros M, Ahringer J (juli 2008). "The art and design of genetic screens: RNA interference". Nature Reviews. Genetics. 9 (7): 554–566. doi:10.1038/nrg2364. PMID 18521077. S2CID 12787125.
  12. 1 2 Gurumurthy CB, Grati M, Ohtsuka M, Schilit SL, Quadros RM, Liu XZ (septembar 2016). "CRISPR: a versatile tool for both forward and reverse genetics research". Human Genetics. 135 (9): 971–976. doi:10.1007/s00439-016-1704-4. PMC 5002245. PMID 27384229.
  13. ↑ Greene EA, Codomo CA, Taylor NE, Henikoff JG, Till BJ, Reynolds SH, et al. (juni 2003). "Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis". Genetics. 164 (2): 731–740. doi:10.1093/genetics/164.2.731. PMC 1462604. PMID 12807792.
  14. ↑ Herman RK, Yochem J (septembar 2005). "Genetic enhancers". WormBook: 1–11. doi:10.1895/wormbook.1.27.1. PMC 4780930. PMID 18023119.
  15. ↑ Puddu F, Oelschlaegel T, Guerini I, Geisler NJ, Niu H, Herzog M, et al. (juni 2015). "Synthetic viability genomic screening defines Sae2 function in DNA repair". The EMBO Journal. 34 (11): 1509–1522. doi:10.15252/embj.201590973. PMC 4474527. PMID 25899817.
  16. ↑ Hodgkin J (decembar 2005). "Genetic suppression". WormBook: 1–13. doi:10.1895/wormbook.1.59.1. PMC 4781008. PMID 18023120.
  17. ↑ Heigwer F, Port F, Boutros M (mart 2018). "RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila". Genetics. 208 (3): 853–874. doi:10.1534/genetics.117.300077. PMC 5844339. PMID 29487145.

Vanjski linkovi

[uredi | uredi izvor]
Preuzeto iz "https://bs.wikipedia.org/w/index.php?title=Genetički_skrining&oldid=3781990"