Gramov metod bojenja
Gramova metoda (Gramovo bojenje ili Gramov metod) je naćin bojenja koji se koristi za klasifikaciju vrsta bakterija u dvije velike grupe: Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije. Može se koristiti i za dijagnosticiranje gljivične infekcije.[1] Naziv potiče od danskog bakteriologa Hansa Christiana Grama, koji je razvio tehniku 1884.[2]
Gramovo bojenje razlikuje bakterije prema hemijskim i fizičkim svojstvima njihovih ćelijskih zidova. Gram-pozitivne ćelije imaju debeli sloj peptidoglikana u ćelijskom zidu koji zadržava primarnu boju, kristal ljubičastu. Gram-negativne ćelije imaju tanji sloj peptidoglikana koji omogućava ispiranje kristal ljubičaste nakon dodavanja etanola. Boje se ružičasto ili crveno kontrabojom,[3] obično safranin omili fuksinom. Rastvor Lugolovog joda se uvijek dodaje nakon dodavanja kristal ljubičaste kako bi se formirao stabilan kompleks sa kristal ljubičastom, koji jača veze boje sa ćelijskim zidom.[4]
Bojenje po Gramu je gotovo uvijek prvi korak u identifikaciji bakterijske grupe. Iako je bojenje po Gramu vrijedan dijagnostički alat i u kliničkim i u istraživačkim okruženjima, ne mogu se sve bakterije definitivno klasificirati ovom tehnikom. To dovodi do gram-varijabilnih i gram-neodređenih grupa.
Historija
[uredi | uredi izvor]Metoda je dobila ime po svom izumitelju, danskom naučniku Hansu Christianu Gramu (1853–1938), koji je razvio tehniku radeći sa Carlom Friedländerom u mrtvačnici gradske bolnice u Berlinu 1884. Gram je osmislio svoju tehniku ne s ciljem razlikovanja jedne vrste bakterija od druge, već da bi bakterije bile vidljivije u obojenim presjecima plućnog tkiva.[5] Gram je primijetio da neke bakterijske ćelije posjeduju značajnu otpornost na promjenu boje. Na osnovu ovih zapažanja, Gram je razvio početni postupak bojenja po Gramu, u početku koristeći Ehrlichovu anilin-encijan ljubičastu, Lugolov jod, apsolutni alkohol za promjenu boje i Bismarck smeđu za kontrastno bojenje.[6] Svoju metodu je objavio 1884. godine i u svoj kratki izvještaj uključio zapažanje da tifusni bacil nije zadržao boju.[7] Gram did not initially make the distinction between Gram-negative and Gram-positive bacteria using his procedure.[6]
Upotreba
[uredi | uredi izvor]
Gramova metoda bojenja je bakteriološka laboratorijska tehnika;[8] koristi se za razlikovanje bakterijskih vrsta u dvije velike grupe (Gram-pozitivne i Gram-negativne) na osnovu fizičkih svojstava njihovih ćelijskih zidova.[9] Bojenje po Gramu se također može koristiti za dijagnosticiranje gljivične infekcije.[1] Ne koristi se za klasifikaciju arheja, budući da ovi mikroorganizmi daju vrlo različite odgovore koji ne prate njihove filogenetičke grupe.[10]
Gram bojenje se izvodi na tjelesnoj tekućini ili biopsijsma, kada se sumnja na infekciju. Gram bojenje daje rezultate mnogo brže od mikrobiološke kulture i posebno je važno kada infekcija može značajno uticati na liječenje i prognozu pacijenta; primjeri su cerebrospinalna tekućina za meningitis i sinovijalna tekućina za sepsni artritis.[11][12]
Mehanizam bojenja
[uredi | uredi izvor]
Gram-pozitivne bakterije imaju debeli mrežasti ćelijski zid napravljen od peptidoglikana (50–90% ćelijske ovojnice), te se kao rezultat toga boje ljubičasto kristal ljubičastom bojom, dok gram-negativne bakterije imaju tanji sloj (10% ćelijske ovojnice), pa ne zadržavaju ljubičastu boju i kontrastno se boje ružičasto safraninom. Postoje četiri osnovna koraka bojenja po Gramu:
- Nanošenje primarne boje (kristal ljubičasta) na razmaz bakterijske kulture fiksiran toplotom. Fiksacija toplotom ubija neke bakterije, ali se uglavnom koristi za pričvršćivanje bakterija na pločicu kako se ne bi isprale tokom postupka bojenja.
- Dodavanje joda, koji se veže za kristal ljubičastu boju i zadržava je u ćeliji
- Brza dekolorizacija sa etanolom ili acetonom
- Kontrastno bojenje sa safraninom.[13] Karbol fuksin se ponekad koristi kao zamjena za safranin jer intenzivnije boji anaerobne bakterije, ali se rjeđe koristi kao kontrastna boja.[14]
| Aplikacija | Reagens | Ćelijska boja | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Gram-pozitivne | Gram-negativne | ||||
| Primarna boja | Kristal ljubičasta | Ljubičasta | Ljubičasta | ||
| Traper | Jod | l Ljubičasta | Ljubičasta | ||
| Sredstvo za uklanjanje boje | alkohol/aceton | Ljubičasta | Bezbojna | ||
| Kontra boja | safranin/karbol fuksin | ljubičasta | Ružičasta ili crvena | ||
Kristalno ljubičasta (CV) disocira u vodenim rastvorima na CV+ i hloridne (Cl–) ione. Ovi ioni prodiru u ćelijski zid i Gram-pozitivnih i Gram-negativnih ćelija. CV+ ion interreaguje sa negativno naelektrisanim komponentama bakterijskih ćelija i boji ćelije u ljubičasto..[15]
Jodid (I– ili I–
3) međureaguje sa CV+ i formira velike komplekse kristal ljubičaste boje i joda (CV–I) unutar unutrašnjih i vanjskih slojeva ćelije. Jod se često naziva mordant, ali je sredstvo za hvatanje koje sprječava uklanjanje CV–I kompleksa i stoga boji ćeliju.[16]
Kada se doda sredstvo za uklanjanje boje poput alkohola ili acetona, ono stupa u interakciju s lipidima ćelijske membrane.[17] Gram-negativna ćelija gubi svoju vanjsku lipopolisaharidnu membranu, a unutrašnji sloj peptidoglikana ostaje izložen. CV–I kompleksi se ispiru iz gram-negativne ćelije zajedno s vanjskom membranom.[18] Nasuprot tome, Gram-pozitivna ćelija dehidrira tretmanom etanolom. Veliki CV–I kompleksi ostaju zarobljeni unutar Gram-pozitivne ćelije zbog višeslojne prirode njenog peptidoglikana.[18] Korak obezbojenja je ključan i mora se pravilno tempirati; kristal violet boja se uklanja i sa Gram-pozitivnih i sa Gram-negativnih ćelija ako se sredstvo za obezbojenje ostavi predugo (nekoliko sekundi).[19]
Nakon obezbojenja, Gram-pozitivna ćelija ostaje ljubičasta, a Gram-negativna gubi svoju ljubičastu boju.[19] Kontrastna boja, koja je obično pozitivno nabijeni safranin ili bazni fuksin, nanosi se posljednja kako bi se obezbojenim Gram-negativnim bakterijama dala ružičasta ili crvena boja.[3][20] == Examples ==
Gram-pozitivne bakterije
[uredi | uredi izvor]
Gram-pozitivne bakterije uglavnom imaju jednu membranu (monoderma) okruženu debelim peptidoglikanom. Ovo pravilo slijede dva koljena: Bacillota (osim klasa Mollicutes i Negativicutes) i Actinomycetota.[9][21] Nasuprot tome, članovi Chloroflexota (zelene nesumporne bakterije) su monodermne, ali posjeduju tanak ili odsutan (klasa Dehalococcoidetes) peptidoglikan i mogu se obojiti negativno, pozitivno ili neodređeno; članovi Deinococcota se boje pozitivno, ali su diderme s debelim peptidoglikanom.[9][21]
Čvrstoća ćelijskog zida je pojačana teihoičnim kiselinama, glikopolimernim supstancama ugrađenim u peptidoglikan. Teihoične kiseline imaju višestruke uloge, kao što su generiranje neto negativnog naboja ćelije, doprinos krutosti ćelijskog zida i održavanju oblika, te pomaganje u diobi ćelija i otpornosti na različite stresore, uključujući toplozu i soli. Uprkos gustoći sloja peptidoglikana, on ostaje relativno porozan, što omogućava prodiranje većine supstanci. Za veće hranjive tvari, Gram-pozitivne bakterije koriste egzoenzime, koji se luče vanćelijski, kako bi razgradile makromolekule izvan ćelije.[22]
Historijski gledano, Gram-pozitivni oblici su činili koljeno Firmicutes, naziv koji se sada koristi za najveću grupu. Uključuje mnoge poznate rodove kao što su Lactobacillus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus i Clostridium.[23] Također je proširen i na Mollicutes, bakterije poput Mycoplasma i Thermoplasma koje nemaju ćelijske zidove i stoga se ne mogu bojeti po Gramu, ali su izvedene iz takvih oblika.[24]
Neke bakterije imaju ćelijske zidove koji su posebno sposobni u zadržavanju boja. One će izgledati pozitivne Gramovom metodom bojenja iako nisu blisko povezane s drugim Gram-pozitivnim bakterijama. One se nazivaju kiselootporne bakterije i mogu se razlikovati od drugih Gram-pozitivnih bakterija samo posebnim postupcima bojenja.[25]
Gram-negativne bakterije
[uredi | uredi izvor]
Gram-negativne bakterije uglavnom posjeduju tanki sloj peptidoglikana između dvije membrane (diderma).[26] Lipopolisaharid (LPS) je najzastupljeniji antigen na površini ćelija većine Gram-negativnih bakterija, čineći do 80% vanjske membrane E. coli i roda Salmonella.[27] Ove LPS molekule, koja se sastoje od O-antigena ili O-polisaharida, središnjeg polisaharida i lipida A, imaju višestruke funkcije, uključujući doprinos negativnom naboju ćelije i zaštitu od određenih hemikalija. Uloga LPS-a je ključna u interakcijama domaćina i patogena, pri čemu O-antigen izaziva imunski odgovor, a lipid A djeluje kao endotoksin.[22]
Osim toga, vanjska membrana djeluje kao selektivna barijera, regulirana porinima, transmembranskim proteinima, koji formiraju pore koje omogućavaju prolaz određenih molekula. Prostor između ćelijske i vanjske membrane, poznat kao periplazma, sadrži periplazmatske enzime za obradu hranjivih tvari. Značajna strukturna komponenta koja povezuje peptidoglikanski sloj i vanjsku membranu je Braunov lipoprotein, koji pruža dodatnu stabilnost i čvrstoću bakterijskom ćelijskom zidu.[22]
Većina bakterijskih koljena su Gram-negativne, uključujući cijanobakterije, zelene sumporne bakterije i većinu Pseudomonadota (izuzeci su neki članovi Rickettsiales i insekti-endosimbionti Enterobacteriales).[9][21]
Gram-varijabilne i Gram-neodređene bakterije
[uredi | uredi izvor]Neke bakterije, nakon bojenja Gram bojom, daju Gram-varijabilni uzorak: vidi se mješavina ružičastih i ljubičastih ćelija.[18][28] U kulturama Bacillus, Butyrivibrio i Clostridium, smanjenje debljine peptidoglikana tokom rasta podudara se s povećanjem broja ćelija koje boje Gram-negativne bakterije.[28] Osim toga, kod svih bakterija obojenih Gram bojom, starost kulture može utjecati na rezultate bojenja.[28]
Gram-neodređene bakterije ne reaguju predvidljivo na Gramovo bojenje i stoga se ne mogu odrediti ni kao Gram-pozitivne ni kao Gram-negativne. Primjeri uključuju mnoge vrste Mycobacterium, uključujući Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae i Mycobacterium tuberculosis, od kojih su posljednje dvije uzročnici lepre i tuberkuloze.[29][30] Bakterije roda Mycoplasma nemaju ćelijski zid oko svojih ćelijskih membrana,[11] što znači da se ne boje Gramovom metodom i otporne su na antibiotike koji ciljaju sintezu ćelijskog zida.[31][32]
Ortografska napomena
[uredi | uredi izvor]Termin Gramovo bojenje potiče od prezimena Hans Christian Gram; eponim (Gram) se stoga piše velikim slovom, ali ne i zajednička imenica (boja) kao što je uobičajeno za naučne termine.[33] Početna slova riječi gram-pozitivni i gram-negativni, koja su eponimni pridjevi, mogu biti veliko G ili malo g, ovisno o tome koji stilski vodič (ako postoji) reguliše dokument koji se piše. Stil s malim slovima koriste američki Centri za kontrolu i prevenciju bolesti i drugi stilski režimi kao što je AMA stil.[34]
Također pogledajte
[uredi | uredi izvor]Reference
[uredi | uredi izvor]- 1 2 "Gram Stain: MedlinePlus Medical Test". medlineplus.gov (jezik: engleski).
- ↑ Colco, R. (2006). Gram Staining. Current Protocols in Microbiology. Appendix 3. str. Appendix 3C. doi:10.1002/9780471729259.mca03cs00. ISBN 978-0-471-72925-9. PMID 18770544. S2CID 32452815.
- 1 2 Beveridge, T. J.; Davies, J. A. (novembar 1983). "Cellular responses of Bacillus subtilis and Escherichia coli to the Gram stain". Journal of Bacteriology. 156 (2): 846–58. doi:10.1128/JB.156.2.846-858.1983. PMC 217903. PMID 6195148.
- ↑ Libenson, L.; McIlroy, A. P. (1. 7. 1955). "On the Mechanism of the Gram Stain". Journal of Infectious Diseases (jezik: engleski). 97 (1): 22–26. doi:10.1093/infdis/97.1.22. ISSN 0022-1899. PMID 13242849.
- ↑ Austrian, R. (1960). "The Gram stain and the etiology of lobar pneumonia, an historical note". Bacteriological Reviews. 24 (3): 261–265. doi:10.1128/MMBR.24.3.261-265.1960. PMC 441053. PMID 13685217.
- 1 2 Bartholomew, James W.; Mittwer, Tod (mart 1952). "THE GRAM STAIN". Bacteriological Reviews (jezik: engleski). 16 (1): 1–29. doi:10.1128/br.16.1.1-29.1952. ISSN 0005-3678. PMC 180726. PMID 14925025.
- ↑ Gram, Hans Christian (1884). "Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten". Fortschritte der Medizin (jezik: njemački). 2: 185–189..
English translation in: Brock, T. D. (1999). Milestones in Microbiology 1546–1940 (2nd izd.). ASM Press. str. 215–218. ISBN 978-1-55581-142-6.
Translation is also at: Brock, T. D. "Pioneers in Medical Laboratory Science: Christian Gram 1884". HOSLink.com. Arhivirano s originala, 10. 8. 2016. Pristupljeno 27. 7. 2010. - ↑ Ryan, K. J.; Ray, C. G., ured. (2004). Sherris Medical Microbiology (4th izd.). McGraw Hill. str. 232f. ISBN 978-0-8385-8529-0.
- 1 2 3 4 Madigan, M. T.; Martinko, J.; Parker, J. (2004). Brock Biology of Microorganisms (10th izd.). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 978-0-13-066271-2.
- ↑ Beveridge, T. J. (2001). "Use of the Gram stain in microbiology". Biotechnic & Histochemistry. 76 (3): 111–118. doi:10.1080/714028139. PMID 11475313.
- 1 2 Ryan KJ, Ray CG (editors) (2004). Sherris Medical Microbiology (4th izd.). McGraw Hill. str. 409–12. ISBN 978-0-8385-8529-0.CS1 održavanje: dodatni tekst: authors list (link)
- ↑ Søgaard, M.; Nørgaard, M.; Schønheyder, H. (2007). "First notification of positive blood cultures: High accuracy of the Gram stain report". Journal of Clinical Microbiology. 45 (4): 1113–1117. doi:10.1128/JCM.02523-06. PMC 1865800. PMID 17301283.
- ↑ Black, Jacquelyn G. (1993). Microbiology: Principles and Explorations. Prentice Hall. str. 65.
- ↑ "Medical Chemical Corporation". Med-Chem.com. Pristupljeno 9. 3. 2016.
- ↑ Leboffe, Michael (2014). Microbiology Laboratory Theory and Application (3rd izd.). Englewood, Colorado: Morton Publishing Company. str. 105. ISBN 978-1-61731-280-9.
- ↑ "Stain theory – What a mordant is not". StainsFile.info. Arhivirano s originala, 9. 3. 2016. Pristupljeno 9. 3. 2016.
- ↑ "Gram Stain". Microbugz. Austin Community College. Arhivirano s originala, 26. 5. 2017. Pristupljeno 26. 5. 2017.
- 1 2 3 Tim, Sandle (21. 10. 2015). Pharmaceutical Microbiology: Essentials for Quality Assurance and Quality Control. Elsevier Science. ISBN 978-0-08-100022-9. OCLC 923807961.
- 1 2 Hardy, Jay; Maria, Santa. "Gram's Serendipitous Stain" (PDF). Hardy's Diagnostics. Arhivirano (PDF) s originala, 24. 3. 2017.
- ↑ Davies, J. A.; Anderson, G. K.; Beveridge, T. J.; Clark, H. C. (novembar 1983). "Chemical mechanism of the Gram stain and synthesis of a new electron-opaque marker for electron microscopy, which replaces the iodine mordant of the stain". Journal of Bacteriology. 156 (2): 837–845. doi:10.1128/JB.156.2.837-845.1983. PMC 217902. PMID 6195147.
- 1 2 3 Brenner, Don J.; Krieg, Noel R.; Staley, James T. (26. 7. 2005) [1984]. Garrity, George M. (ured.). Introductory Essays. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2A (2nd izd.). New York: Springer. str. 304. ISBN 978-0-387-24143-2. British Library no. GBA561951.
- 1 2 3 Bruslind, Linda (1. 8. 2019). General Microbiology (jezik: engleski). Oregon State University.
- ↑ Galperin, Michael Y. (27. 12. 2013). "Genome Diversity of Spore-forming Firmicutes". Microbiology Spectrum. 1 (2): TBS-0015-2012-. doi:10.1128/microbiolspectrum.tbs-0015-2012. ISSN 2165-0497. PMC 4306282. PMID 26184964.
- ↑ Hashem, Hams H. "Practical Medical Microbiology". University of Al-Qadisiya. Arhivirano s originala, 14. 2. 2019.
- ↑ "The Acid Fast Stain". www2.Highlands.edu. Georgia Highlands College. Arhivirano s originala, 10. 6. 2017. Pristupljeno 10. 6. 2017.
- ↑ Megrian D, Taib N, Witwinowski J, Gribaldo S (2020). "One or two membranes? Diderm Firmicutes challenge the Gram-positive/Gram-negative divide". Molecular Microbiology. 113 (3): 659–671. doi:10.1111/mmi.14469. PMID 31975449. S2CID 210882600.
- ↑ Avila-Calderón ED, Ruiz-Palma MD, Contreras-Rodríguez A (2021). "Outer Membrane Vesicles of Gram-Negative Bacteria: An Outlook on Biogenesis". Frontiers in Microbiology. 12. doi:10.3389/fmicb.2021.557902. PMC 7969528. PMID 33746909.
- 1 2 3 Beveridge, Terry J. (mart 1990). "Mechanism of Gram Variability in Select Bacteria". Journal of Bacteriology. 172 (3): 1609–1620. doi:10.1128/jb.172.3.1609-1620.1990. PMC 208639. PMID 1689718.
- ↑ Black, Jacquelyn (2012). Microbiology: Principles and Exploration (8th izd.). John Wiley & Sons. str. 68. ISBN 978-0-470-54109-8.
- ↑ Reynolds, J.; Moyes, R. B.; Breakwell, D. P. (2009). Differential Staining of Bacteria: Acid Fast Stain. Current Protocols in Microbiology. 15. str. Appendix 3H. doi:10.1002/9780471729259.mca03hs15. ISBN 978-0-471-72925-9. PMID 19885935. S2CID 45685776.
- ↑ Lee EH, Winter HL, van Dijl JM, Metzemaekers JD, Arends JP (decembar 2012). "Diagnosis and antimicrobial therapy of Mycoplasma hominis meningitis in adults". International Journal of Medical Microbiology. 302 (7–8): 289–92. doi:10.1016/j.ijmm.2012.09.003. PMID 23085510.
- ↑ Gautier-Bouchardon AV (juli 2018). "Antimicrobial Resistance in Mycoplasma spp". Microbiology Spectrum. 6 (4): 425–446. doi:10.1128/microbiolspec.ARBA-0030-2018. ISBN 978-1-55581-979-8. PMC 11633602 Provjerite vrijednost parametra
|pmc=(pomoć). PMID 30003864. S2CID 51616821. - ↑ Waddingham, Anne (28. 8. 2014). New Hart's Rules: The Oxford Style Guide. Oxford University Press. str. 105. ISBN 978-0-19-957002-7.
- ↑ "Preferred Usage". Emerging Infectious Diseases Style Guide. Centers for Disease Control and Prevention.
Vanjski linkovi
[uredi | uredi izvor]
|
|
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||