Razlika između verzija stranice "Polimorfizam dužine amplificiranih fragmenata"

S Wikipedije, slobodne enciklopedije
[pregledana izmjena][pregledana izmjena]
Uklonjeni sadržaj Dodani sadržaj
m fix homoglyphs: convert Cyrillic characters in [о]d to Latin
m fix homoglyphs: convert Cyrillic characters in mjestim[а] to Latin
Red 4: Red 4:
== Analiza ==
== Analiza ==
Protokol detekcije AFLP polimorfizma uključuje nekoliko glavnih postupaka.
Protokol detekcije AFLP polimorfizma uključuje nekoliko glavnih postupaka.
*Dugi lanac [[DNK]] [[makromolekula]] se najprije siječe pomoću [[restrikcijski enzim|restrikcijskih enzima]], koji se inače široko koriste kao rezači (sjekači) [[molekula]] DNK na tačno određenim specifičnim mjestimа. Svaki pojedinačni prepoznaje ’’svoju’’ sekvencu [[nukleotid]]a, npr. 5'−GТТАТCА−3', pa kada klizi duž lanca, svaki puta prepoznaje taj kod i tu ga siječe. Najčešće su upotrebi oni restrikcijski enzimi joji prepoznaju i režu sekvence od četiri do šest [[nukleotid]]a. U ovakvim istraživanjima, obično se koriste po dva specifična enzima, od kojih jedan prepoznaje sekvence od četiri, a drugi od šest nukleotida.
*Dugi lanac [[DNK]] [[makromolekula]] se najprije siječe pomoću [[restrikcijski enzim|restrikcijskih enzima]], koji se inače široko koriste kao rezači (sjekači) [[molekula]] DNK na tačno određenim specifičnim mjestima. Svaki pojedinačni prepoznaje ’’svoju’’ sekvencu [[nukleotid]]a, npr. 5'−GТТАТCА−3', pa kada klizi duž lanca, svaki puta prepoznaje taj kod i tu ga siječe. Najčešće su upotrebi oni restrikcijski enzimi joji prepoznaju i režu sekvence od četiri do šest [[nukleotid]]a. U ovakvim istraživanjima, obično se koriste po dva specifična enzima, od kojih jedan prepoznaje sekvence od četiri, a drugi od šest nukleotida.


*Zatim sječeni fragmenti [[DNK]] ma jednom kraju imaju sekvencu koja prepoznaje šestočlani, a na drugom onu koja prepoznaje četveročlani. Spajanje fragmenata katalizira enzim [[ligaza]], koja je u funkciji svojevrsnog ljepila za spajanje sekvenci adaptera. Kao adapteri služe poznate oligonukleotidne sekvence koje su tako komponirane da na jednom kraju ima takav nukleotidni niz koji je komplementaran sekvenci prepoznavanja jednog od korištenih restrikcijskih enzima, a na drugom – sekvencu nukleotida koja je komplementarna sekvenci prajmera ((početnice) koji će biti upotrebljen u preamplifikaciji. U tom slučaju, adapter iva dvostruku ulogu: njegovim vezanjem za kraj fragmenta nestaje mjesto koje prepoznaju [[restrikcijski enzim|restrikcijski enzimi]], uz istovrenmeno uspostavljanje mjesta za koje će se vezati prajmer.
*Zatim sječeni fragmenti [[DNK]] ma jednom kraju imaju sekvencu koja prepoznaje šestočlani, a na drugom onu koja prepoznaje četveročlani. Spajanje fragmenata katalizira enzim [[ligaza]], koja je u funkciji svojevrsnog ljepila za spajanje sekvenci adaptera. Kao adapteri služe poznate oligonukleotidne sekvence koje su tako komponirane da na jednom kraju ima takav nukleotidni niz koji je komplementaran sekvenci prepoznavanja jednog od korištenih restrikcijskih enzima, a na drugom – sekvencu nukleotida koja je komplementarna sekvenci prajmera ((početnice) koji će biti upotrebljen u preamplifikaciji. U tom slučaju, adapter iva dvostruku ulogu: njegovim vezanjem za kraj fragmenta nestaje mjesto koje prepoznaju [[restrikcijski enzim|restrikcijski enzimi]], uz istovrenmeno uspostavljanje mjesta za koje će se vezati prajmer.

Verzija na dan 15 februar 2018 u 17:06

Polimorfizam dužine amplificiranih fragmenata (eng. Amplified Fragment Length Polymorphism: AFLP) јеedan је od najznačajnijih i najširw primjenjivanih genetičkih markera u brojnim oblastima bioloških istraživanja Primjenjuje se od molekularne biologije i genetike domikrobiologije, ekologije i rekonstrukcije evolucijsko-filogenetika|filogenetičkih]] veza i odnosa. Proučavanje ovog polimorfizma je posebno značajno i u medicini, u procesima genotipizacije.[1]

Analiza

Protokol detekcije AFLP polimorfizma uključuje nekoliko glavnih postupaka.

  • Dugi lanac DNK makromolekula se najprije siječe pomoću restrikcijskih enzima, koji se inače široko koriste kao rezači (sjekači) molekula DNK na tačno određenim specifičnim mjestima. Svaki pojedinačni prepoznaje ’’svoju’’ sekvencu nukleotida, npr. 5'−GТТАТCА−3', pa kada klizi duž lanca, svaki puta prepoznaje taj kod i tu ga siječe. Najčešće su upotrebi oni restrikcijski enzimi joji prepoznaju i režu sekvence od četiri do šest nukleotida. U ovakvim istraživanjima, obično se koriste po dva specifična enzima, od kojih jedan prepoznaje sekvence od četiri, a drugi od šest nukleotida.
  • Zatim sječeni fragmenti DNK ma jednom kraju imaju sekvencu koja prepoznaje šestočlani, a na drugom onu koja prepoznaje četveročlani. Spajanje fragmenata katalizira enzim ligaza, koja je u funkciji svojevrsnog ljepila za spajanje sekvenci adaptera. Kao adapteri služe poznate oligonukleotidne sekvence koje su tako komponirane da na jednom kraju ima takav nukleotidni niz koji je komplementaran sekvenci prepoznavanja jednog od korištenih restrikcijskih enzima, a na drugom – sekvencu nukleotida koja je komplementarna sekvenci prajmera ((početnice) koji će biti upotrebljen u preamplifikaciji. U tom slučaju, adapter iva dvostruku ulogu: njegovim vezanjem za kraj fragmenta nestaje mjesto koje prepoznaju restrikcijski enzimi, uz istovrenmeno uspostavljanje mjesta za koje će se vezati prajmer.
  • Slijedeći korak u ovom postupki je preamplifikacija. U reakcijsku smjesu se dodaju prajmeri koji su komplementarni sekvencama adaptera i mjesta prepoznavanja restrikcijskih enzima, uz dodatak jednog nukleotida na 3'kraju. To omogućava da se se umnožavaju samo one sekvence koje na kraju imaju komplement određenog nukleotida, što 16 puta smanjuj broj fragmenata za analizu.
  • Posljednji postupak u ovom procesu je selektivna amplifikacija, kada se u reakcijsku smjesu dodaju prethodno određeni prajmeri sa poznatim sekvencama, odnosno sekvencama prajmera koji su korišteni u preamplifikaciji, uz dodatak nekoliko (1-5) asumičnih nukleotida koji se dodaju na 3'kraju. Odrednicu selektivna amplifikacija ovaj postupak je dobio po tome što je selektivno kontroliran. Kao finalni rezultat, od početnog mnoštva fragmenata, аmplificiraju se samo određeni, sa obično 50-100 nukleotida.
  • Po završetku amplifikacije ostaje rastvor za analizu, koja najprije podrazumijeva elektrogorezu za diferenciraju molekula DNK po veličini, zahvaljujući različitoj pokretljivosti u električnom polju.

Opisana procedura omogućava genetičku identifikaciju i genotipizaciju.

Primjena

Tehnologija AFLP može istovremeno otkrivati različite polimorfizme u različitim regijama genoma Vrlo je osjetljiva i ponovljiva. Zato se analiza AFLP naširoko koristi za identifikaciju genetičkih varijacija u sojevima ili bliskim vrstama biljaka, gljiva, životinja i bakterija. Tehnologija AFLP se koristi i u kriminološkim laboratorijama, u testiranje roditeljstva, a također I u utvrđivanju malih razlika unutar populacija. U asocijacijskim studijama (povezanosti) mogu generirati mape za lokuse kvantitativnih osobina (‘’QTL’’).

Postoje mnoge prednosti u odnosu na druge tehnologije drugih AFLP markera , uključujući slučajno pojačane polimorfne DNK (RAPD), polimorfizam dužine restrikcijskih fragmenata (RFLP) i mikrosatelita. U odnosu na druge tehnike, AFLP samo nema veću ponovljivost, rezoluciju i osjetljivost na nivou cijelog genoma, ali također ima sposobnost da amplificira između 50 i 100 fragmenata u jednom postupku. Osim toga, bez prethodnih informacija koje su potrebne za amplifikaciju sekvenci Tehnologija AFLP je zaštićena patentima i patentnim prijavama u Keygene N.V. AFLP je registriran kao zaštitni znak Keygene N.V.Keygene NV. AFLP je registrirani zaštitni znak Keygene NV.

Reference

  1. ^ Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, ISBN 9958-9344-1-8.

Vanjski linkovi

Softver za analizu AFLP podataka

Besplatna pomagala za analizu AFLP podataka

  • SourceForge Genographer Free software for manual scoring (Java application)
  • SourceForge RawGeno Free automated scoring (R CRAN environment, including a user-friendly GUI)

Online programi za simulaciju AFLP-PCR