Replikacija eukariotske DNK
Replikacija eukariotske DNK, znana i kao eukariotska replikacija DNK je konzervirani mehanizam koji ograničava replikaciju DNK na jedan proces po ćelijskom ciklusu. Replikacija eukariotske hromosomske DNK je centralna za umnožavanje ćelija i neophodna je za održavanje eukariotskog genoma.
Replikacija DNK odvija se djelovanjem DNK-polimeraza sinteze DNK lanca komplementarnog originalnom šablonskom lancu. Da bi se sintetizirala DNK, dvolančana DNK se odmotava pomoću DNK-helikaze ispred polimeraza, formirajući replikacijsku viljušku, koja sadrži dva jednolančana šablona. Procesi replikacije dozvoljavaju kopiranje jedne dvostruke spirale DNK u dvije spirale DNK, koje su podijeljene na ćelije kćeri u mitozi. Glavne enzimske funkcije koje se izvode na replikacijskoj viljušci dobro su konzervirane od prokariota do eukariota, ali mehanizam za replikaciju u replikaciji eukariotske DNK je mnogo veći kompleks, koji koordinira mnoge proteine na mjestu replikacije, formirajući replisome.[1]
Replisom je odgovoran za kopiranje cjelokupne genomske DNK u svakoj proliferativnoj ćeliji. Ovaj proces omogućava precizan prolaz nasljednih/genetskih informacija od roditeljske ćelije do ćelije kćeri i stoga je neophodan za sve organizme. Veći dio ćelijskog ciklusa je izgrađen oko osiguravanja da se replikacija DNK odvija bez grešaka.[1]
U G1 faza ćelijskog ciklusa, pokreću se mnogi regulatorni procesi replikacije DNK. Kod eukariota, velika većina sinteze DNK se dešava tokom S-faze ćelijskog ciklusa, a cijeli genom se mora odmotati i duplicirati kako bi se formirale dvije kćeri kopije. Tokom G2, svaka oštećena DNK ili greške u replikaciji se ispravljaju. Konačno, jedna kopija genoma se segregira na svaku ćeliju kćer u mitozi ili M fazi.[2] Ove ćerke kopije svaka sadrže po jedan lanac roditeljske dupleksne DNK i jedan antiparalelni lanac u nastajanju.
Ovaj mehanizam je konzerviran od prokariota do eukariota i poznat je kao semikonzervativna replikacija DNK. Proces polukonzervativne replikacije za mjesto replikacije DNK je struktura DNK nalik na viljušku, viljuška za replikaciju, gdje je spirala DNK otvorena ili odmotana, izlažući nesparenu DNK nukleotide za prepoznavanje i uparivanje baza za ugradnju slobodnih nukleotida u dvolančanu DNK.[3]
Inicijacija[uredi | uredi izvor]
Inicijacija replikacije eukariotske DNK je prva faza sinteze DNK u kojoj se dvostruka spirala DNK odmotava i početni događaj prajminga DNK-polimerazom α javlja se na vodećem lancu. Događaj prajmiranja na zaostalom nizu uspostavlja viljušku za replikaciju. Prajmiranje DNK heliksa sastoji se od sinteze RNK-prajmera da bi se omogućila sinteza DNK pomoću DNK-polimeraze α. Prajming se dešava jednom na početku na vodećem polulancu i na početku svakog Okazaki fragmenta na zaostajućoj niti.
Replikacija DNK pokreće se iz specifičnih sekvenci koje se nazivaju porijekla replikacija, a eukariotske ćelije imaju višestruko porijeklo replikacije. Da bi započeli replikaciju DNK, okupljaju se višestruki replikativni proteini i odvajaju od ovih replikativnih izvora.[4] Pojedinačni faktori djeluju zajedno kako bi usmjerili formiranje prereplikacijskog kompleksa (pre-RC), ključnog posrednika u procesu inicijacije replikacije.
Povezivanje kompleksa prepoznavanje porijekla (ORC) s porijeklom replikacije regrutuje protein 6 ciklusa diobe ćelije (Cdc6) kako bi formirao platformu za punjenje održavanje minihromozomskog ( Mcm 2-7) kompleksa proteina, olakšanog licenciranjem hromatina i proteinskog faktora 1 replikacije DNK (Cdt1). ORC, Cdc6 i Cdt1 zajedno su potrebni za stabilnu povezanost kompleksa Mcm2-7 sa replikativnim porijeklom tokom G1 faze ćelijskog ciklusa.[5]
Elongacija[uredi | uredi izvor]
Formiranje prereplikacijskog kompleksa (pre-RC) označava potencijalna mjesta za iniciranje replikacije DNK. U skladu sa kompleksom održavanja minihromosoma koji okružuje dvolančanu DNK, formiranje pre-RC ne dovodi do trenutnog odmotavanja izvorne DNK ili regrutacije DNK-polimeraza. Umjesto toga, pre-RC koji se formira tokom G1 ćelijskog ciklusa aktivira se samo da odmota DNK i započne replikaciju nakon što ćelije pređu iz G1 u S fazu ćelijskog ciklusa.[2]
Jednom kada se formira inicijacijski kompleks i ćelije pređu u S-fazu, kompleks tada postaje replisom. Eukariotski replisomski kompleks odgovoran je za koordinaciju replikacija DNK. Replikaciju na vodećim i zaostalim lancima obavljaju DNK-polimeraza ε i DNK-polimeraza δ. Mnogi faktori replisoma uključujući klaspin, And1, faktor replikacije C-stezaljke i kompleks za zaštitu viljuške odgovorni su za regulaciju funkcija polimeraze i koordinaciju sinteze DNK sa odmotavanjem lanca šablona pomoću kompleksa Cdc45-Mcm-GINS. Kako se DNK odmota, broj uvijanja se smanjuje. Da bi se to kompenziralo, broj navoja se povećava, uvodeći pozitivne superspiralu u DNK. Ove superzavojnice bi izazvale zaustavljanje replikacije DNK ako se ne uklone. Topoizomeraze su odgovorne za uklanjanje ovih superzavojnica ispred viljuške za replikaciju.
Replisom je odgovoran za kopiranje cjelokupne genomske DNK u svakoj proliferativnoj ćeliji. Reakcije uparivanja baza i formiranja lanaca, koje formiraju heliks kćer, kataliziraju DNK polimeraze.[6] Ovi enzimi se kreću duž jednolančane DNK i omogućavaju produžavanje lanca DNK u nastajanju "čitanjem" šablonskog lanca i omogućavanjem inkorporacije odgovarajućih purinskih nukleobaza, adenina i [ [guanin]]a i pirimidinskih nukleobaza, timina i citozina. Aktivirani slobodni dezoksiribonukleotidi postoje u ćeliji kao dezoksiribonukleotid-trifosfati (dNTP). Ovi slobodni nukleotidi se dodaju izloženoj 3'-hidroksilnoj grupi na posljednjem ugrađenom nukleotidu. U ovoj reakciji oslobađa se pirofosfat, iz slobodnog dNTP, stvarajući energiju za reakciju polimerizacije i izlažući 5' monofosfat, koji je zatim kovalentno vezan za 3' kisik. Dodatno, pogrešno umetnuti nukleotidi mogu biti uklonjeni i zamijenjeni ispravnim nukleotidima u energetski povoljnoj reakciji. Ovo svojstvo je od vitalnog značaja za pravilno čitanje i popravku grešaka koje se javljaju tokom replikacija DNK.
Terminacija[uredi | uredi izvor]
Završetak replikacije eukariotske DNK zahtijeva različite procese ovisno o tome da li su hromosomi kružni ili linearni. Za razliku od linearnih molekula, kružni hromosomi mogu replicirati cijeli molekul. Međutim, dva molekula DNK će ostati povezana zajedno. Ovaj problem se rješava dekatenacijom dva molekula DNK pomoću topoizomeraze tipa II. Topoizomeraze tipa II se također koriste za razdvajanje linearnih lanaca jer su složeno presavijeni u nukleosom unutar ćelije.
Kao što je ranije spomenuto, linearni hromosomi se suočavaju sa još jednim problemom koji se ne vidi u replikaciji kružne DNK. Zbog činjenice da je RNK prajmer potreban za iniciranje sinteze DNK, zaostali lanac je u nedostatku u replikaciji cijelog hromosoma. Dok vodeći lanac može koristiti jedan RNK-prajmer da produži 5' kraj replicirajućeg lanca DNK, višestruki RNK-prajmeri su odgovorni za zaostalu sintezu lanca, stvarajući Okazaki fragmente. Ovo dovodi do problema zbog činjenice da se DNK-polimeraza može dodati samo na 3' kraj lanca DNK. 3'-5' djelovanje DNK polimeraze duž roditeljskog lanca ostavlja kratku jednolančanu regiju DNK (ssDNK) na 3' kraju roditeljskog lanca kada su Okazaki fragmenti popravljeni. Budući da se replikacija događa u suprotnim smjerovima na suprotnim krajevima roditeljskih hromosoma, svaki lanac je na jednom kraju onaj koji zaostaje. Vremenom bi to rezultiralo progresivnim skraćivanjem oba hromosoma kćeri. Ovo je poznato kao problem krajnje replikacije.[1]
Problem krajnje replikacije u eukariotskim ćelijama rješavaju telomerni regioni i telomeraza. Telomere protežu 3' kraj roditeljskog hromosoma izvan 5' kraja kćerke. Ova jednolančana DNK struktura može djelovati kao izvorište replikacije koja regrutuje telomerazu. Telomeraza je specijalizovana DNK-polimeraza koja se sastoji od više proteinskih podjedinica i RNK komponente. RNK komponenta telomeraze spaja se na jednolančani 3' kraj šablonske DNK i sadrži 1,5 kopija telomerne sekvence.[7] Telomeraza sadrži proteinsku podjedinicu koja je reverzna transkriptaza tzv. telomerazno reverzna transkriptaza ili TERT. TERT sintetizira DNK do kraja šablonske telomeraze RNK, a zatim se odvaja.[7] Ovaj proces se može ponoviti onoliko puta koliko je potrebno sa produženjem 3' kraja roditeljske DNK molekule. Ovaj dodatak od 3' obezbjeđuje šablon za produžavanje 5' kraja lanca kćeri zaostajućom sintezom DNK lanca. Regulacijom aktivnosti telomeraze upravljaju proteini koji vezuju telomere.
Poređenja između replikacije prokariotske i eukariotske DNK[uredi | uredi izvor]
U poređenju sa NK replikacijom, završetak replikacije eukariotske DNK je složeniji i uključuje višestruko porijeklo replikacije i replikacijske proteine za postizanje. Prokariotska DNK je raspoređena u kružnom obliku i ima samo jedno ishodište replikacije kada replikacija počne. Nasuprot tome, eukariotska DNK je linearna. Kada se replicira, postoji čak hiljadu izvora replikacije.[8]
Eukariotska DNK je dvosmjerna. Ovdje je značenje dvosmjernosti drugačije. Eukariotska linearna DNK ima mnogo porijekala (nazvanih O) i završetaka (zvanih T). "T" se nalazi desno od "O". Jedan "O" i jedan "T" zajedno čine jedan replikon. Nakon formiranja preinicijacijskog kompleksa, kada jedan replikon započne elongaciju, inicijacija počinje u drugom replikonu. Sada, ako se prvi replikon kreće u smjeru kazaljke na satu, drugi replikon se kreće u smjeru suprotnom od kazaljke na satu, sve dok se ne dostigne "T" prvog replikona. Na "T", oba replikona se spajaju kako bi završili proces replikacije. U međuvremenu, drugi replikon se također kreće u pravcu naprijed, da bi se susreo sa trećim replikonom. Ovo kretanje dva replikona u smjeru kazaljke na satu i suprotno od kazaljke na satu naziva se dvosmjerna replikacija.
Replikacija eukariotske DNK zahtijeva preciznu koordinaciju svih DNK-polimeraza i povezanih proteina kako bi se replicirao cijeli genom svaki put kada se ćelija podijeli. Ovaj proces se postiže nizom koraka proteinskih sklopova na početku replikacije, uglavnom fokusirajući regulaciju replikacije DNK na povezanost MCM helikaze sa DNK. Ovi izvori replikacije usmjeravaju broj proteinskih kompleksa koji će se formirati kako bi pokrenuli replikaciju. U prokariotskoj DNK, regulacija replikacije se fokusira na vezivanje proteina inicijatora DNKA za DNK, pri čemu se inicijacija replikacije događa više puta tokom jednog ćelijskog ciklusa.[7] I prokariotska i eukariotska DNK koriste ATPvezivanje i hidrolizu za direktno učitavanje helikaze i u oba slučaja helikaza se učitava u neaktivnom obliku. Međutim, eukariotske helikaze su dvostruki heksameri koji se stavljaju na dvolančanu DNK, dok su prokariotske helikaze jednostruki heksameri naneseni na jednolančanu DNK.[9]
Segregacija hromosoma je još jedna razlika između prokariotskih i eukariotskih ćelija. Ćelije koje se brzo dijele, kao što su bakterije, često će početi da odvajaju hromosome koji su još u procesu replikacije. U eukariotskim ćelijama segregacija hromosoma u ćelije kćeri ne započinje sve dok se replikacija ne završi u svim hromosomima.[7] Uprkos ovim razlikama, međutim, osnovni proces replikacije je sličan i za prokariotsku i za eukariotsku DNK.
| Replikacija prokariotske DNK | Replikacija eukariotske DNK |
|---|---|
| Javlja se unutar citoplazme | Javlja se unutar jedra |
| Samo jedno porijeklo replikacije po molekuli DNK | Imaju mnogo porijekala replikacije u svakom hromosomu |
| Porijeklo replikacije je dužine oko 100-200 ili više nukleotida | Svako porijeklo replikacije formirano je od oko 150 nukleotida |
| Replikacija se dešava u jednoj tački u svakom hromosomu | Replikacija se dešava na nekoliko tačaka istovremeno u svakom hromosomu |
| Imaju samo jedno porijeklo replikacije | Imaju multipla porijekla replikacije |
| Inicijaciju izvode proteini A-DNK i B-DNK | Inicijaciju provodi Kompleks za prepoznavanje porijekla |
| Potrebna je topoizomeraza | Potrebna je topoizomeraza |
| Imaju duge Okazaki fragmente, duge 1000-2000 nukleotida | Imaju kratke Okazaki fragmente, duge 100-200 nukleotida |
| Replikacija je veoma brza | Replikacija je veoma spora |
Lista proteina replikacije eukariotske DNK[uredi | uredi izvor]
| Protein | Funkcija u replikaciji eukariotske DNK |
|---|---|
| AND1 | Učitava DNK polimerazu α na hromatin zajedno sa CMG kompleksom na lancu koji zaostaje. Također poznat kao Ctf4 u pupajućem kvascu. |
| CDC45 | Potreban za inicijaciju i korake elongacije replikacije DNK. Dio kompleksa helikaze Mcm2-7. Potreban nakon pre-RC koraka za punjenje različitih proteina za inicijaciju i elongaciju. |
| Cdc45-Mcm-GINS (CMG) kompleks | Funkcionalna DNK-helikaza u eukariotskim ćelijama |
| Cdc6 | Potrebno za sklapanje kompleksa Mcm2-7 u ORC-u, u kombinaciji sa Cdt1. |
| Cdc7-Dbf4 kinaza ili Dbf4-zavisna kinaza (DDK) | Protein-kinaza potrebna za iniciranje replikacije DNK, vjerovatno putem fosforilacija proteina za održavanje minihromosoma. |
| Cdt1 | Učitava Mcm2-7 kompleks na DNK u ORC-u u koraku prije RC/licenciranja. Kod metazoa inhibiran gemininom. |
| Klaspin | Uparuje sintezu vodećeg lanca sa aktivnošću helikaze kompleksa CMG. Radi sa Mrc1 |
| Ctf4 | Učitava DNK polimerazu α na hromatin zajedno sa CMG kompleksom na lancu koji zaostaje. Homolog kod metazoa je poznat kao AND-1. |
| Ciklin-ovisna kinaza (CDK) | Protein-kinaza ovisna od ciklina potrebna za pokretanje replikacije i za druge naredne korake. |
| DNK2 | 5' endonukleaza i helikaza uključene u obradu Okazaki fragmenata. |
| DNK ligaza I | Spaja Okazaki fragmente tokom replikacija DNK. Aktivnost ligaze je takođe potrebna za popravku i rekombinaciju DNK. |
| DNK polimeraza α (Pol α) | Sadrži aktivnost primaze koja je neophodna za pokretanje sinteze DNK na vodećim i zaostalim lancima. |
| DNK polimeraza δ (Pol δ) | Potreban za potpunu sintezu Okazaki fragmenata na zaostalom lancu koje je pokrenula DNK-polimeraza α. |
| DNK-polimeraza ε (Pol ε) | Polimeraza vodećeg lanca. Sintetizira DNK na replikacijskoj viljuški. Veže se rano na početku preko Dbp11 i potrebno je za punjenje DNK-polimeraze α. |
| Dpb11 | Protein inicijacije replikacije DNK. Učitava DNK-polimerazu ε na komplekse prije replikacije na početku. |
| Fen1 | 5' endonukleaza režnja uključena u obradu Okazaki fragmenata. |
| Geminin | Protein koji se nalazi u metazoama i nema ga u kvascima. Veže se i inaktivira Cdt1, čime regulira formiranje kompleksa pre replikacije/inicijacije. Također se predlaže da se promovira formiranje pre-RC, vezivanjem i na taj način sprečava degradacija Cdt1 |
| GINS | Tetramerni kompleks sastavljen od Sld5, Psf1, Psf2, Psf3. Povezuje se s predreplikacijskim kompleksom oko vremena inicijacije i kreće se sa replikacijskim viljuškama tokom koraka elongacije. Potreban za fazu elongacije replikacije DNK i možda dio kompleksa Mcm helikaze. |
| Proteini održavanja minihromosoma (Mcm) | Šest različitih proteina iz porodice AAA+ ATPaza koji formiraju heksamer u rastvoru. Ovaj heksamer regrutuju i pune ORC, Cdc6 i Cdt1 i formira dvostruki heksamer koji je topološki vezan oko DNK, kako bi formirao kompleks prereplikacije otporan na soli. Prilikom pokretanja replikacije, Mcm2-7 se udaljava od ORC-a s viljuškom za replikaciju. |
| Mcm10 | Potreban za faze inicijacije i elongacije replikacije DNK. Uključen je u vezivanje hromatina Cdc45 i DNK-polimeraze α. Također je potrebno za stabilnost katalitske podjedinice DNK-polimeraze α u pupajućem kvascu S. cerevisiae. |
| Mrc1 | Uparivanje sinteze vodećeg lanca sa aktivnošću helikaznog kompleksa CMG. Homolog metazoa je poznat kao klaspin. |
| Kompleks za prepoznavanje porijekla (ORC) | Heteroheksamerni kompleks sastavljen od Orc1–Orc6 proteina. Veže se za DNK i sastavlja Mcm2-7 kompleks na kromatin zajedno sa Cdc6 i Cdt1. |
| Proliferirajući jedarni ćelijski antigen (PCNA) | Trimerni protein sa strukturom u obliku prstena, obuhvata DNK, sprečavajući disocijaciju DNK polimeraze. Djeluje kao klizna stezaljka za polimeraze δ i ε, čime se poboljšava procesnost replikacijskih polimeraza. |
| Replikacijski faktor C (RFC) | Učitava PCNA na pripremljene šablone i učestvuje u prebacivanju između DNK-polimeraze a i replikativnih polimeraza δ i ε. |
| Barijere replikacijske viljuške (RFB) | Vezani proteinima RFB na različitim lokacijama u genomu. Mogu prekinuti ili pauzirati replikacijske viljuške, zaustavljajući napredovanje replisoma. |
| Replikacijski protein A (RPA) | Heterotrimerni jednolančani vezni protein. Stabilizira jednolančanu DNK na replikacijskoj viljuški. |
| H | Ribonukleaza koja razgrađuje RNK hibridiziranu u DNK. Uključena u obradu Okazaki fragmenata. |
| Sld2 | Funkcije u pokretanju replikacije. Ključni supstrat CDK, fosforilacija podstiče interakciju sa Dpb11. Potrebna za pokretanje replikacije. |
| Sld3 | Funkcije u pokretanju replikacije. Ključni supstrat CDK, fosforilacija podstiče interakciju sa Dpb11. Potrebna za pokretanje replikacije. |
| Telomeraza | Ribonukleoprotein koji dodaje sekvencu DNK TTAGGG, ponavlja u telomerama se na 3' kraju lanaca DNK. |
| Topoizomeraza | Regulira premotavanje ili presavijanje DNK |
Također pogledajte[uredi | uredi izvor]
Reference[uredi | uredi izvor]
- ^ a b c Leman AR, Noguchi E (March 2013). "The replication fork: understanding the eukaryotic replication machinery and the challenges to genome duplication". Genes. 4 (1): 1–32. doi:10.3390/genes4010001. PMC 3627427. PMID 23599899.
- ^ a b Blow JJ, Dutta A (juni 2005). "Preventing re-replication of chromosomal DNA". Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6): 476–86. doi:10.1038/nrm1663. PMC 2688777. PMID 15928711.
- ^ Fisher PA, Wang TS, Korn D (July 1979). "Enzymological characterization of DNA polymerase alpha. Basic catalytic properties processivity, and gap utilization of the homogeneous enzyme from human KB cells". The Journal of Biological Chemistry. 254 (13): 6128–37. doi:10.1016/S0021-9258(18)50528-7. PMID 447699.
- ^ Araki H (2011). "Initiation of chromosomal DNA replication in eukaryotic cells; contribution of yeast genetics to the elucidation". Genes & Genetic Systems. 86 (3): 141–9. doi:10.1266/ggs.86.141. PMID 21952204.
- ^ Maiorano D, Moreau J, Méchali M (april 2000). "XCDT1 is required for the assembly of pre-replicative complexes in Xenopus laevis". Nature. 404 (6778): 622–5. Bibcode:2000Natur.404..622M. doi:10.1038/35007104. PMID 10766247. S2CID 4416138.
- ^ Lehman IR, Bessman MJ, Simms ES, Kornberg A (juli 1958). "Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. I. Preparation of substrates and partial purification of an enzyme from Escherichia coli". The Journal of Biological Chemistry. 233 (1): 163–70. doi:10.1016/S0021-9258(19)68048-8. PMID 13563462.
- ^ a b c d Tye BK (1999). "MCM proteins in DNA replication". Annual Review of Biochemistry. 68 (1): 649–86. doi:10.1146/annurev.biochem.68.1.649. PMID 10872463.
- ^ Meselson M, Stahl FW (juli 1958). "The replication of DNA in Escherichia coli". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 44 (7): 671–82. Bibcode:1958PNAS...44..671M. doi:10.1073/pnas.44.7.671. PMC 528642. PMID 16590258.
- ^ Bell SP, Kaguni JM (juni 2013). "Helicase loading at chromosomal origins of replication". Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6): a010124. doi:10.1101/cshperspect.a010124. PMC 3660832. PMID 23613349.