Idi na sadržaj

Transkriptomske tehnologije

Nepregledano
S Wikipedije, slobodne enciklopedije

Transkriptomske tehnologije su tehnike koje se koriste za proučavanje transkriptoma organizma, zbira svih njegovih RNK transkripata. Informacijski sadržaj organizma zabilježen je u DNK njegovog genoma i eksprimira se putem transkripcije. Ovdje iRNK služi kao privremena posrednička molekula u informacijskoj mreži, dok nekodirajuće RNK obavljaju dodatne raznolike funkcije. Transkriptom bilježi vremenski snimak ukupnih transkripata prisutnih u ćeliji. Transkriptomske tehnologije pružaju širok uvid u to koji su ćelijski procesi aktivni, a koji uspavani. Glavni izazov u molekularnoj biologiji je razumjeti kako jedan genom dovodi do nastanka različitih ćelija. Drugi je kako je regulirana ekspresija gena.

Prvi pokušaji proučavanja cijelih transkriptoma započeli su početkom 1990-ih. Naknadni tehnološki napredak od kasnih 1990-ih više je puta transformirao ovo polje i učinio transkriptomiku široko rasprostranjenom disciplinom u biološkim naukama. Postoje dvije ključne savremene tehnike u ovom polju: mikročipovi, koji kvantificiraju skup unaprijed određenih sekvenci, i RNK-Seq, koji koristi sekvenciranje visokog protoka za snimanje svih transkripata. Kako se tehnologija poboljšavala, količina podataka proizvedenih svakim eksperimentom s transkriptomom se povećavala. Kao rezultat toga, metodi analize podataka su se stalno prilagođavale kako bi se preciznije i efikasnije analizirale sve veće količine podataka. Baze podataka transkriptoma posljedično su postale veće i korisnije kako istraživači nastavljaju prikupljati i dijeliti transkriptome. Bilo bi gotovo nemoguće interpretirati informacije sadržane u transkriptomu bez poznavanja prethodnih eksperimenata.

Mjerenje ekspresija gena organizma u različitim tkivima ili biofizičkim uslovima, ili u različitim vremenima, daje informacije o tome kako su geni regulirani i otkriva detalje o biologiji organizma. Također se može koristiti za zaključivanje o fenotipu prethodno neanalitiranim genima. Analiza transkriptoma omogućila je proučavanje kako se ekspresija gena mijenja u različitim organizmima i bila je instrumentalna u razumijevanju ljudskih bolesti. Analiza ekspresije gena u cjelini omogućava otkrivanje širokih koordiniranih trendova koji se ne mogu uočiti ciljanijim testovima.

Historija

[uredi | uredi izvor]
Korištenje transkriptomskog metoda tokom vremena. Objavljeni radovi koji se odnose na RNK-Seq (crno), RNK mikročip (crveno), eksprimiranu oznaku sekvence (plavo), digitalni diferencijalni prikaz (zeleno) i serijsku/kap analizu ekspresije gena (žuto) od 1990.[1]

Transkriptomiku karakterizira razvoj novih tehnika koje su redefinirale ono što je moguće svake decenije ili nešto više i učinile prethodne tehnologije zastarjelim. Prvi pokušaj snimanja djelimičnog ljudskog transkriptoma objavljen je 1991. godine i izvijestio je o 609 sekvenci iRNK iz ljudskog mozga.[2] U 2008. godini objavljena su dva ljudska transkriptoma, sastavljena od miliona sekvenci izvedenih iz transkripta koje pokrivaju 16.000 gena,[3][4] i do 2015. godine objavljeni su transkriptomi za stotine osoba.[5][6] Transkriptomi različitih bolesnih stanja, tkiva ili čak pojedinačnih ćelija se sada rutinski generiraju.[6][7][8] Ova eksplozija u transkriptomici uzrokovana je brzim razvojem novih tehnologija s poboljšanom osjetljivošću i ekonomičnošću.[9][10][11][12]

Prije transkriptomike

[uredi | uredi izvor]

Studije pojedinačnih transkripata su se provodile nekoliko decenija prije nego što su bili dostupni bilo kakvi transkriptomski pristupi. Biblioteke svilenog moljca iRNK transkripti su prikupljeni i pretvoreni u komplementarnu DNK (cDNK) za skladištenje korištenjem reverzne transkriptaze krajem 1970-ih.[13] Tokom 1980-ih, sekvenciranje niskog protoka korištenjem Sangerove metode korišteno je za sekvenciranje nasumičnih transkripata, proizvodeći eksprimirane oznake sekvenci (EST).[2][14][15][16] Sangerova metoda sekvenciranja bila je dominantna sve do pojave metods visokog protoka kao što je sekvenciranje sintezom (Solekda/Illumina). EST-ovi postali su istaknuti tokom 1990-ih kao efikasan metod za određivanje sadržaja gena organizma bez sekvenciranje cijelog genoma.[16] Količine pojedinačnih transkripata kvantificirane su korištenjem metoda Northern blot, najlonske membranske sekvence, a kasnije i Lančana reakcija polimeraze s reverznom transkripcijom|kvantitativna PCR s reverznom transkriptazom (RT-qPCR),[17][18] ali ovi metodi su mukotrpni i mogu uhvatiti samo mali pododjeljak transkriptoma. Posljedično, način na koji se transkriptom kao cjelina eksprimira i regulira ostao je nepoznat sve dok nisu razvijene tehnike većeg protoka.

Rani pokušaji

[uredi | uredi izvor]

Riječ "transkriptom" prvi put je upotrijebljena 1990-ih.[19][20] Godine 1995. razvijen je jeda n od najranijih transkriptomskih metoda zasnovanih na sekvenciranju, serijska analiza genske ekspresije (SAGE), koja je radila na principu Sangerovog sekvenciranja spojenih nasumičnih transkriptnih fragmenata.[21] Transkripti su kvantificirani usklađivanjem fragmenata s poznatim genima. Varijanta SAGE-a koja koristi tehnike sekvenciranja visokog protoka, nazvana digitalna analiza [ ekspresije gena, također je kratko korištena.[22] Međutim, ove metode su uveliko nadmašene visokopropusnim sekvenciranjem cijelih transkripata, što je pružilo dodatne informacije o strukturi transkripta kao što su varijante splajsovanja.

Razvoj suvremenih tehnika

[uredi | uredi izvor]
Poređenje suvremenih metoda[10][23][24]
RNK-Seq Mikročip
Propusnost 1 dan do 1 sedmica po eksperimentu[10] 1–2 dana po eksperimentu[10]
Unesena količina RNK Niska ~ 1 ng ukupna RNK[25] Visok ~ 1 μg iRNK[26]
Intenzitet rada Visok (priprema uzorka i analiza podataka)[10][23] Nizak[10][23]
Predznanje Nije potrebno, iako je referentna sekvenca genoma/transkriptoma korisna[23][23] Referentni genom/transkriptom je potreban za dizajn sondi[23]
Kvantifikacija tačnost ~90% (ograničeno pokrivenošću sekvence)[27] >90% (ograničeno tačnošću detekcije fluorescencija)[27]
Rezolucija sekvence RNK-Seq može detektovati SNP-ove i varijante splajsovanja (ograničeno tačnošću sekvenciranja)[27] Specijalizirani nizovi mogu detektirati varijante splajsovanja iRNK (ograničeno dizajnom sonde i unakrsnom hibridizacijom)[27]

98%

Osjetljivost 1 transkript na milion (približno, ograničeno pokrivenošću sekvence)[27] 1 transkript na hiljadu (približno, ograničeno detekcijom fluorescencije)[27]
Dinamički raspon 100.000:1 (ograničeno pokrivenošću sekvence)[28] 1.000:1 (ograničeno zasićenjem fluorescencija)[28]
Tehnička reproducibilnost >99%[29][30] >99%[31][32]

Dominantne savremene tehnike, DNK-mikročipovi i RNK-Seq, razvijene su sredinom 1990-ih i 2000-ih.[9][33] Mikročipovi koji mjere količinu definiranog skupa transkripata putem njihove hibridizacija s nizom komplementarnih sondi prvi put su objavljeni 2004.[34][35] Tehnologija mikročipova omogućila je istovremenu analizu hiljada transkripata, uz znatno smanjene troškove po genu i uštedu rada.[36] I uočeni oligonukleotidni nizovi i Affymetrix sekvence visoke gustoće bili su metod izbora za transkripcijsko profiliranje do kasnih 2000-ih.[12][33] Tokom ovog perioda, proizveden je niz mikročipova kako bi se pokrili poznati geni u modelu ili ekonomski važnim organizmima. Napredak u dizajnu i proizvodnji sekvecin poboljšao je specifičnost proba i omogućio testiranje više gena na jednom nizu. Napredak u detekciji fluorescencije povećao je osjetljivost i tačnost mjerenja za transkripte s niskom abundancijom.[35][37]

RNK-Seq se postiže reverznom transkripcijom RNK in vitro i sekvenciranjem rezultirajućih cDNK.[10] Brojnost transkripta se izvodi iz brojanja iz svakog transkripta. Stoga je tehnika bila pod velikim uticajem razvoja tehnologije sekvenciranja visokog protoka.[9][11] Masivno paralelno sekvenciranje potpisa (MPSS) bio je rani primjer zasnovan na generiranju 16-20  mjerenje dužine bp sekvenci putem složene serije hibridizacija,[38][note 1] i korišten je 2004. godine za validaciju ekspresije deset hiljada gena kod Arabidopsis thaliana.[39] Najraniji rad o RNK-Seq objavljen je 2006. godine sa sto hiljada transkripata sekvenciranih korištenjem 454 tehnologije.[40] Ovo je bila dovoljna pokrivenost za kvantifikaciju relativne zastupljenosti transkripata. RNK-Seq je počeo da dobija na popularnosti nakon 2008., kada su nove Illumina tehnologije omogućile snimanje jedne milijarde transkriptnih sekvenci.[4][10][41][42] Ovaj prinos sada omogućava kvantifikaciju i poređenje ljudskih transkriptoma.[43]

Prikupljanje podataka

[uredi | uredi izvor]

Generiranje podataka o RNK transkriptima može se postići putem dva glavna principa: sekvenciranjem pojedinačnih transkripata (EST ili RNK-Seq) ili hibridizacijom transkripata u uređeni niz nukleotidnih proba (mikročipova).[23]

Izolacija RNK

[uredi | uredi izvor]

Sve transkriptomske metode zahtijevaju da se RNK prvo izoluje iz eksperimentalnog organizma prije nego što se transkripti mogu snimiti. Iako su biološki sistemi nevjerovatno raznoliki, tehnike ekstrakcija RNK su uglavnom slične i uključuju mehaničko poremećaj ćelija ili tkiva, poremećaj RNaze sa haotropnim solima,[44] razbijanje makromolekula i nukleotidnih kompleksa, odvajanje RNK od neželjenih biomolekula, uključujući DNK, i koncentriranje RNK putem precipitacije iz rastvora ili elucije iz čvrste matrice.[44][45] Izolirana RNK može se dodatno tretirati DNKazom kako bi se probavili svi tragovi DNK.[46] Neophodno je obogatiti informacijsku RNK jer ukupni ekstrakti RNK obično sadrže 98% ribosomske RNK.[47] Obogaćivanje transkripta može se izvršiti metodima afiniteta za poli-A ili deplecijom ribosomske RNK, korištenjem sekvencno specifičnih proba.[48] Degradirana RNK može uticati na rezultate naknadne analize; naprimjer, obogaćivanje iRNK iz degradiranih uzoraka rezultirat će iscrpljivanjem 5' krajeva KRNA i neujednačenim signalom po cijeloj dužini transkripta. Snap zamrzavanje tkiva prije izolacije RNK je tipično, a vodi se računa da se smanji izloženost RNaze enzimima nakon što je izolacija završena.[45]

Oznake eksprimirane sekvence

[uredi | uredi izvor]

Oznaka eksprimirane sekvence (EST) je kratka nukleotidna sekvenca generirana iz jednog RNK transkripta. RNK se prvo kopira kao komplementarna DNK (cDNK) pomoću enzima reverzne transkriptaze prije nego što se rezultirajuća cDNK sekvencira.[16] Budući da se EST-ovi mogu prikupljati bez prethodnog poznavanja organizma iz kojeg potiču, mogu se napraviti od mješavina organizama ili uzoraka iz okoliša.[16][49] Iako se sada koriste metodi većeg protoka, EST biblioteke su obično pružale informacije o sekvenci za rane dizajne mikročipova; naprimjer, mikročip ječma je dizajniran od 350.000 prethodno sekvenciranih EST-ova.[50]

Serijska i kap analiza genske ekspresije (SAGE/CAGE)

[uredi | uredi izvor]
Sažetak SAGE. Unutar organizama, geni se transkribiraju i splajsuju (kod eukariota) kako bi se proizveli zreli transkripti iRNK (crveno). iRNK se ekstrahuje iz organizma, a reverzna transkriptaza se koristi za kopiranje iRNK u stabilnu dvolančanu cDNK (ds-cDNK; plavo). U SAGE-u, ds-cDNK se probavlja pomoću restrikcijskih enzima (na lokaciji 'X' i 'X'+11), kako bi se proizveli fragmenti "oznake" od 11 nukleotida. Ove oznake se spajaju i sekvenciraju korištenjem dugog čitanja Sangerovog sekvenciranja (različite nijanse plave označavaju oznake iz različitih gena). Sekvence se dekonvoluiraju kako bi se pronašla učestalost svake oznake. Učestalost oznake može se koristiti za izvještavanje o transkripciji gena od kojeg oznaka potiče.[51]

Serijska analiza ekspresije gena (SAGE) bila je razvoj EST metodologije s ciljem povećanja propusnosti generiranih oznaka i omogućavanja kvantifikacije količine transkripta.[21] cDNK se generira iz RNK, ali se zatim razgrađuje na 11 bp "oznake" fragmente korištenjem restrikcijskih enzima koji režu DNK na specifičnoj sekvenci i 11 baznih parova duž te sekvence. Ove cDNK oznake se zatim spajaju glava-rep u duge lance (>500 bp) i sekvenciraju korištenjem metoda niskog propusnog opsega, ali duge dužine čitanja kao što je Sangerovo sekvenciranje. Sekvence se zatim dijele nazad na svoje originalne oznake od 11 bp pomoću računarskog softvera u procesu koji se naziva dekonvolucija.[21] Ako je dostupan visokokvalitetni referentni genom, ove oznake se mogu upariti sa odgovarajućim genom u genomu. Ako referentni genom nije dostupan, oznake se mogu direktno koristiti kao dijagnostički markeri ako se utvrdi da su diferencijalno eksprimirane u bolesnom stanju.[21]

Metod analiza genske ekspresije kapom (CAGE) je varijanta SAGE-a koja sekvencira oznake samo od 5' kraja transkripta iRNK.[52] Stoga se Mjesto početka transkripcije gena može identificirati kada su oznake poravnate s referentnim genomom. Identificiranje mjesta početka gena korisno je za analizu promotora i za kloniranje cDNK pune dužine.

SAGE i CAGE metodi daju informacije o više gena nego što je to bilo moguće pri sekvenciranju pojedinačnih EST-ova, ali priprema uzoraka i analiza podataka obično zahtijevaju više rada.[52]

Mikročipovi

[uredi | uredi izvor]
Sažetak DNK mikročipova. Unutar organizama, geni se transkribiraju i splajsiraju (kod eukariota) kako bi se proizveli zreli iRNK transkripti (crveno). iRNK se ekstrahira iz organizma, a reverzna transkriptaza se koristi za kopiranje mRNA u stabilnu ds-cDNK (plavo). U mikročipovima, ds-cDNK je fragmentirana i fluorescentno označena (narandžasto). Označeni fragmenti se vežu za uređeni niz komplementarnih oligonukleotida, a mjerenje intenziteta fluorescencije preko sekvence ukazuje na brojnost unaprijed određenog skupa sekvenci. Ove sekvence su obično posebno odabrane da izvještavaju o genima od interesa unutar genoma organizma.[51]

Principi i napredak

[uredi | uredi izvor]

Mikročipovi se obično sastoje od mreže kratkih nukleotidnih oligonukleotidnih oligomera, poznatih kao "molekularne sonde", obično raspoređenih na staklenoj pločici.[53] Brojnost transkripta određuje se hibridizacijom fluorescentno obilježenih transkripata s ovim sondama.[54]intenzitet fluorescencije na svakoj lokaciji probe na sekvenci označava količinu transkripta za tu sekvencu probe.[54] Grupe sondi dizajniranih za mjerenje istog transkripta (tj. hibridizaciju specifičnog transkripta na različitim pozicijama) obično se nazivaju "setovi sondi".

Mikročipovi zahtijevaju određeno genomsko znanje organizma od interesa, na primjer, u obliku anotirane genomske sekvence ili biblioteke EST-ova koji se mogu koristiti za generiranje sondi za niz.[36]

Metode

[uredi | uredi izvor]

Mikročipovi za transkriptomiku obično spadaju u jednu od dvije široke kategorije: sekvence niske gustoće s tačkama ili nizovi kratkih sondi visoke gustoće. Obilje transkripta se zaključuje iz intenziteta fluorescencije izvedene iz transkripata označenih fluoroforom koji se vežu za sekvencu.[36]

Tačkaste sekvence niske gustoće obično sadrže pikolitru[note 2] kapi niza pročišćenih cDNK raspoređenih na površini staklene pločice.[55] Ove sonde su duže od onih sa sekvencama visoke gustoće i ne mogu identificirati događaje alternativnog spajanja. Tačkaste sekvence koriste dva različita fluorofora za označavanje testnih i kontrolnih uzoraka, a omjer fluorescencije se koristi za izračunavanje relativne mjere obilja.[56] Nizovi visoke gustoće koriste jednu fluorescentnu oznaku, a svaki uzorak se hibridizira i detektira pojedinačno.[57] Nizovi visoke gustoće popularizirani su nizom Affymetrix GeneChip, gdje se svaki transkript kvantificira pomoću nekoliko kratkih 25 oligomernih sondi koje zajedno test jedan gen.[58]

NimbleGen nizovi su bili nizovi visoke gustoće proizvedeni metodom maskless-fotohemija, koja je omogućavala fleksibilnu proizvodnju nizova u malim ili velikim količinama. Ovi nizovi su imali 100.000 proba od 45 do 85 mera i hibridizirani su s uzorkom označenim jednom bojom za analizu ekspresije.[59] Neki dizajni su uključivali do 12 nezavisnih nizova po pločici.

RNK-Seq

[uredi | uredi izvor]
Sažetak RNK-Seq. Unutar organizama, geni se transkribiraju i splajsiraju (kod eukariota) kako bi se proizveli zreli transkripti iRNK (crveno). iRNK se ekstrahira iz organizma, fragmentira i kopira u stabilnu ds-cDNK (plavo). ds-cDNK se sekvencira korištenjem visokog protoka, metod sekvenciranja kratkog čitanja. Ove sekvence se zatim mogu poravnati s referentnom sekvencom genoma kako bi se rekonstruiralo koje su regije genoma transkribirane. Ovi podaci se mogu koristiti za označavanje gdje se nalaze eksprimirani geni, njihovi relativni nivoi ekspresije i sve alternativne varijante splajsovanja.[51]

Principi i napredak

[uredi | uredi izvor]

RNK-Seq se odnosi na kombinaciju metodologije sekvenciranje visokog protoka s računarskim metodima za hvatanje i kvantificiranje transkripata prisutnih u ekstraktu RNK.[10] Generirane nukleotidne sekvence su obično dugačke oko 100 bp, ali mogu se kretati od 30 bp do preko 10.000 bp, ovisno o korištenom metodu sekvenciranja. RNK-Seq koristi duboko uzorkovanje transkriptoma s mnogo kratkih fragmenata iz transkriptoma kako bi omogućio računarsku rekonstrukciju originalnog RNK transkripta putem usklađivanje očitavanja s referentnim genomom ili jedno s drugim (de novo sastavljanje).[9] I RNK s niskom i visokom količinom mogu se kvantificirati u RNK-Seq eksperimentu (dinamički raspon od 5 redova veličine) - ključna prednost u odnosu na transkriptome s mikročipovima. Osim toga, ulazne količine RNK su mnogo niže za RNK-Seq (količina u nanogramima) u usporedbi s mikročipovima (količina u mikrogramima), koji omogućuju ispitivanje transkriptoma čak i pri rezoluciji jedne ćelije kada se kombiniraju s amplifikacijom cDNK[25][60] Teorijski, ne postoji gornja granica kvantifikacije u RNK-Seq, a pozadinska buka je vrlo niska za očitavanja od 100 bp u neponavljajućim regijama.[10]

RNK-Seq se može koristiti za identifikaciju gena unutar genoma ili za identifikaciju gena koji su aktivni u određenom trenutku, a broj očitavanja se može koristiti za precizno modeliranje relativnog nivoa ekspresija gena. Metodologija RNK-Seq se stalno poboljšava, prvenstveno kroz razvoj tehnologija sekvenciranja DNK radi povećanja propusnosti, tačnosti i dužine očitavanja.[61] Od prvih opisa 2006. i 2008.,[40][62] RNK-Seq je brzo usvojen i pretekao mikročipove kao dominantnu transkriptomsku tehniku 2015. godine.[63]

Potraga za transkriptomskim podacima na nivou pojedinačnih ćelija dovela je do napretka u metodama pripreme RNA-Seq biblioteka, što je rezultiralo dramatičnim napretkom u osjetljivosti. Transkriptomi pojedinačnih ćelija su sada dobro opisani i čak su prošireni na In situ RNK-Seq gdje se transkriptomi pojedinačnih ćelija direktno ispituju u fiksiranim tkivima.[64]

Metodi

[uredi | uredi izvor]

RNK-Seq je osnovan u skladu s brzim razvojem niza visokopropusnih tehnologija sekvenciranja DNK]].[65] Međutim, prije nego što se ekstrahovani RNK transkripti sekvenciraju, provodi se nekoliko ključnih koraka obrade. Metodi se razlikuju u korištenju obogaćivanja transkripta, fragmentacije, amplifikacije, sekvenciranja jednog ili parnog kraja, te u tome da li se čuvaju informacije o lancu.[65]

Osjetljivost RNA-Seq eksperimenta može se povećati obogaćivanjem klasa RNK koje su od interesa i smanjenjem poznatih obilnih RNK. Molekule iRNK mogu se razdvojiti korištenjem oligonukleotidnih proba koje se vežu za njihove poli-A repove. Alternativno, ribo-deplecija se može koristiti za specifično uklanjanje obilnih, ali neinformativnih ribosomskih RNK (rRNK) hibridizacijom sa probama prilagođenim specifičnim sekvencama rRNK taksona (npr. rRNK sisara, rRNK biljaka). Međutim, ribo-deplecija također može unijeti određenu pristranost putem nespecifičnog smanjenja transkripata izvan cilja.[66] Male RNK, kao što su mikro RNK, mogu se pročistiti na osnovu njihove veličine gel elektroforezom i ekstrakcijom.

Budući da su iRNK duže od dužina očitavanja tipičnih metoda sekvenciranja visokog protoka, transkripti se obično fragmentiraju prije sekvenciranja.[67] Metod fragmentacije je ključni aspekt konstrukcije biblioteke sekvenciranja. Fragmentacija se može postići hemijskom hidrolizom, nebulizacijom, sonikacijom ili reverznom transkripcijom sa nukleotidima koji terminiraju lanac.[67] Alternativno, fragmentacija i označavanje cDNK mogu se izvršiti istovremeno korištenjem enzima transpozaze.[68]

Tokom pripreme za sekvenciranje, kopije transkripata cDNK mogu se amplificirati pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR) kako bi se obogatile fragmentima koji sadrže očekivane 5' i 3' adapterske sekvence.[69] Amplifikacija se također koristi kako bi se omogućilo sekvenciranje vrlo malih ulaznih količina RNK, čak do 50 pikograma (pg) u ekstremnim primjenama.[70]Spike-in kontrole poznatih RNK mogu se koristiti za procjenu kontrole kvalitetas, kako bi se provjerila priprema i sekvenciranje biblioteke, u smislu GC-sadržaja, dužine fragmenta, kao i pristranosti zbog položaja fragmenta unutar transkripta.[71]Jedinstveni molekularni identifikatori (UMI) su kratke nasumične sekvence koje se koriste za pojedinačno označavanje fragmenata sekvenci tokom pripreme biblioteke tako da je svaki označeni fragment jedinstven.[72] UMI-ovi pružaju apsolutnu skalu za kvantifikaciju, mogućnost korekcije naknadne pristranosti amplifikacije uvedene tokom konstrukcije biblioteke i tačnu procjenu početne veličine uzorka. UMI-ovi su posebno pogodni za transkriptomiku RNK-Seq pojedinačnih ćelija, gdje je količina ulazne RNK ograničena i potrebna je proširena amplifikacija uzorka.[73][74][75]

Nakon što su molekule transkripta pripremljene, mogu se sekvencirati u samo jednom smjeru (jednostruki kraj) ili u oba smjera (upareni kraj). Sekvenca jednostrukog kraja se obično brže proizvodi, jeftinija je od sekvenciranja uparenih krajeva i dovoljna je za kvantifikaciju nivoa ekspresije gena. Sekvenciranje uparenih krajeva proizvodi robusnija poravnanja/sklapanja, što je korisno za anotaciju gena i otkrivanje transkripta izoforma.[10] Metode sekvenciranja specifične za lanac RNA čuvaju informacije o lancu sekvenciranog transkripta.[76] Bez informacija o lancu, očitavanja se mogu poravnati s lokusom gena, ali ne informiraju u kojem smjeru se gen transkribira. Stranded-RNK-Seq je koristan za dešifriranje transkripcije za gene koji se preklapaju u različitim smjerovima i za donošenje robusnijih predviđanja gena u nemodelnim organizmima.[76]

Platforme za sekvenciranje koje se obično koriste za RNK-Seq[77][78]
Platforma Komercijalno izdanje Tipična dužina čitanja Maksimalni protok po pokretanju Tačnost pojedinačnog čitanja RNK-Seq analize deponovane u NCBI SRA (oktobar 2016.)[79]
454 Biološke nauka 2005. 700 bp 0,7 Gbp 99,9% 3548
Illumina 2006. 50–300 bp 900 Gbp 99,9% 362903
SOLiD 2008. 50 bp 320 Gbp 99,9% 7032
Ionski torent 2010. 400 bp 30 Gbp 98% 1953.
PacBio 2011. 10.000 bp 2 Gbp 87% 160

Legenda: NCBI SRA – Arhiv čitanja sekvenci informacija Nacionalnog centra za biotehnologiju.

Sada se RNK-Seq oslanja na kopiranje molekula RNK u molekule cDNK prije sekvenciranja; stoga su naknadne platforme iste za transkriptomske i genomske podatke. Posljedično, razvoj tehnologija sekvenciranja DNK bio je definirajuća karakteristika RNK-Seq-a..[78][80][81] Direktno sekvenciranje RNK korištenjem sekvenciranja nanopora predstavlja trenutno najsavremeniju tehniku RNK-Seq.[82][83] Sekvenciranje RNK nanoporama može detektovati modifikovane baze koje bi inače bile maskirane prilikom sekvenciranja cDNK, a takođe eliminiše korake amplifikacije DNK koji bi inače mogli uvesti pristrasnost.[11][84]

Osjetljivost i tačnost RNK-Seq eksperimenta zavise od broja očitavanja dobijenih iz svakog uzorka.[85][86] Potreban je veliki broj očitavanja kako bi se osigurala dovoljna pokrivenost transkriptoma, omogućavajući detekciju transkripata s niskom abundancijom. Eksperimentalni dizajn dodatno komplikuju tehnologije sekvenciranja s ograničenim rasponom izlaza, varijabilna efikasnost kreiranja sekvenci i varijabilni kvalitet sekvenci. Pored ovih razmatranja, svaka vrsta ima drugačiji broj gena i stoga zahtijeva prilagođeni prinos sekvenci za efikasan transkriptom. Rane studije su empirijski određivale odgovarajuće pragove, ali kako je tehnologija sazrijevala, odgovarajuća pokrivenost je računarski predviđena zasićenjem transkriptoma. Pomalo kontraintuitivno, najefikasniji način za poboljšanje detekcije diferencijalne ekspresije u genima s niskom ekspresijom je dodavanje više bioloških replika umjesto dodavanja više očitavanja.[87] Trenutni kriteriji koje preporučuje projekat Enciklopedija DNK elemenata (ENCODE) su 70-struka pokrivenost egzoma za standardno RNK-Seq i do 500-struka pokrivenost egzoma za detekciju rijetkih transkripata i izoformi.[88][89][90]

Analiza podataka

[uredi | uredi izvor]

Transkriptomske metode su visoko paralelne i zahtijevaju značajna izračunavanja kako bi se dobili značajni podaci za eksperimente s mikročipovima i RNK-Seq.[91][92][93][94][95] Podaci mikročipova se snimaju kao slike visoke rezolucije, što zahtijeva detekciju karakteristika (računarski vid) i spektarsku analizu.[96] Datoteke mikročipova u sirovim slikama su veličine oko 750 MB, dok su obrađeni intenziteti veličine oko 60 MB. Višestruke kratke sonde koje odgovaraju jednom transkriptu mogu otkriti detalje o strukturi intron-egzon, što zahtijeva statističke modele za utvrđivanje autentičnosti rezultirajućeg signala. Studije RNK-Seq proizvode milijarde kratkih DNK sekvenci, koje moraju biti usklađene sa referentnim genomom sastavljenim od miliona do milijardi baznih parova. De novo sastavljanje očitavanja unutar skupa podataka zahtijeva konstrukciju vrlo složenih grafova sekvenci.[97] RNK-Seq operacije su vrlo repetitivne i imaju koristi od paralelnog računanja, ali moderni algoritmi znače da je hardver za potrošačko računanje dovoljan za jednostavne transkriptomske eksperimente koji ne zahtijevaju de novo sastavljanje očitavanja.[98] Ljudski transkriptom mogao bi se precizno uhvatiti korištenjem RNK-Seq sa 30 miliona sekvenci od 100 bp po uzorku.[85][86] Ovaj primjer bi zahtijevao približno 1,8 gigabajta prostora na disku po uzorku kada se pohrani u komprimiranom fastq formatu. Obrađeni podaci o brojanju za svaki gen bili bi mnogo manji, ekvivalentni obrađenim intenzitetima mikročipova. Podaci o sekvenci mogu se pohraniti u javne repozitorije, kao što je Sequence Read Archive (SRA).[99] RNK-Seq skupovi podataka mogu se učitati putem Gene Expression Omnibusa.[100]

Obrada slike

[uredi | uredi izvor]
Mikročip i protočna ćelija za sekvenciranje. Mikročipovi i RNK-sekvenciranje oslanjaju se na analizu slike na različite načine. U mikročipnom čipu, svaka tačka na čipu je definirana oligonukleotidna sonda, a intenzitet fluorescencija direktno detektuje zastupljenost specifične sekvence (Affymetrix). U protočnoj ćeliji za sekvenciranje visokog protoka, tačke se sekvenciraju jedan nukleotid u isto vrijeme, pri čemu boja u svakom krugu označava sljedeći nukleotid u sekvenci (Illumina Hiseq). Druge varijacije ovih tehnika koriste više ili manje kanala boja.[51][101]

Mikročipna obrada slike mora ispravno identificirati regularnu mrežu karakteristika unutar slike i nezavisno kvantificirati fluorescenciju intenzitet za svaku karakteristiku. artefakti slike moraju se dodatno identificirati i ukloniti iz ukupne analize. Intenziteti fluorescencije direktno ukazuju na brojnost svake sekvence, budući da je sekvenca svake probe na nizu već poznata.[102]

Prvi koraci RNA-sekvenciranja također uključuju sličnu obradu slike; međutim, konverziju slika u podatke o sekvenciranju obično automatski obavlja softver instrumenta. Metod sekvenciranja sintezom Illumina rezultira nizom klastera raspoređenih po površini protočne ćelije.[103] Protočna ćelija se snima do četiri puta tokom svakog ciklusa sekvenciranja, sa ukupno desetinama do stotinama ciklusa. Klasteri protočnih ćelija su analogni tačkama mikročipa i moraju se ispravno identificirati tokom ranih faza procesa sekvenciranja. U metodi pirosekvenciranja kompanije Roche, intenzitet emitirane svjetlosti određuje broj uzastopnih nukleotida u homopolimernom ponavljanju. Postoje mnoge varijante ovih metoda, svaka sa drugačijim profilom greške za rezultirajuće podatk.[104]

Analiza podataka RNK-Seq

[uredi | uredi izvor]

RNK-Seq eksperimenti generiraju veliku količinu sirovih sekvenci koje se moraju obraditi kako bi se dobile korisne informacije. Analiza podataka obično zahtijeva kombinaciju bioinformatičkog softverskog alata (pogledajte također Lista bioinformatičkih alata RNK-Seq) koji variraju u zavisnosti od eksperimentalnog dizajna i ciljeva. Proces se može podijeliti u četiri faze: kontrola kvaliteta, poravnanje, kvantifikacija i diferencijalna ekspresija.[105] Većina popularnih RNK-Seq programa se pokreće iz sučelja komandne linije, bilo u Unix okruženju ili unutar statističkog okruženja programski biokonduktor.[94]

Kontrola kvaliteta

[uredi | uredi izvor]

Očitavanja sekvenci nisu savršena, tako da je potrebno procijeniti tačnost svake baze u sekvenci za daljnje analize. Sirovi podaci se ispituju kako bi se osiguralo: da su rezultati kvaliteta za pozive baza visoki, da se GC sadržaj podudara s očekivanom distribucijom, da kratki motivi sekvenci (k-meri) nisu previše zastupljeni i da je stopa duplikacije očitavanja prihvatljivo niska.[86] Postoji nekoliko softverskih opcija za analizu kvaliteta sekvenci, uključujući FastQC i FaQC.[106][107] Abnormalnosti se mogu ukloniti (skraćivati) ili označiti za poseban tretman tokom kasnijih procesa.

Poravnanje

[uredi | uredi izvor]

Da bi se povezala brojnost očitavanja sekvenci sa ekspresijom određenog gena, transkriptne sekvence se poravnavaju sa referentnim genomom ili de novo poravnavaju jedna s drugom ako referenca nije dostupna.[108][109][110] Ključni izazovi za softver za poravnanje uključuju dovoljnu brzinu koja omogućava poravnanje milijardi kratkih sekvenci u značajnom vremenskom okviru, fleksibilnost za prepoznavanje i rješavanje intronskog splajsovanja eukariotske iRNK i ispravno dodjeljivanje očitavanja koja se mapiraju na više lokacija. Napredak softvera je u velikoj mjeri riješio ove probleme, a povećanje dužine sekvenciranja smanjuje vjerovatnoću dvosmislenih poravnanja očitavanja. Listu trenutno dostupnih visokopropusnih poravnavača sekvenci održava EBI.[111][112]

Poravnanje sekvenci primarnog transkripta iRNK izvedenih iz eukariota s referentnim genomom zahtijeva specijalizirano rukovanje sekvencama introna, koje nisu prisutne u zreloj iRNK.[113] Poravnavači kratkog čitanja izvode dodatnu rundu poravnanja posebno dizajniranih za identifikaciju spojeva spajanja, informiranih kanonskim sekvencama mjesta spajanja i poznatim informacijama o mjestu spajanja introna. Identifikacija spojeva introna spajanja sprječava pogrešno poravnanje očitavanja preko spojeva spajanja ili pogrešno odbacivanje, omogućavajući poravnanje više očitavanja s referentnim genomom i poboljšavajući tačnost procjena ekspresija gena. Budući da se regulacija gena može dogoditi na nivou izoforme iRNK, poravnanja svjesna spajanja također omogućavaju detekciju promjena u broju izoformi koje bi se inače izgubile u skupnoj analizi.[114]

De novo sklop se može koristiti za poravnavanje očitavanja jednih s drugima kako bi se konstruirale transkriptne sekvence pune dužine bez upotrebe referentnog genoma.[115] Izazovi specifični za de novo sastavljanje uključuju veće računarske zahtjeve u poređenju sa transkriptomom zasnovanim na referencama, dodatnu validaciju genskih varijanti ili fragmenata i dodatne anotacije sastavljenih transkripata. Prve metrike korištene za opisivanje sklopova transkriptoma, kao što su N50, pokazale su se obmanjujućim[116] i poboljšane metode evaluacije su sada dostupne.[117][118] Metrike zasnovane na anotacijama su bolje procjene potpunosti sastavljanja, kao što je contig recipročni broj najboljih pogodaka. Nakon što se sastavi de novo, sklop se može koristiti kao referenca za naknadne metode poravnanja sekvenci i kvantitativnu analizu ekspresije gena.

RNK-Seq de novo softver za sastavljanje
Softver Objavljeno Posljednje ažuriranje Računska efikasnost Snage i slabosti
Velvet-Oases[119][120] 2008. 2011. Nizak, jednonitni, visoki zahtjevi za RAM memorijom Originalni asembler za kratko čitanje. Sada je uglavnom zamijenjen.
SOAPdenovo-trans[109] 2011. 2014. Umjereni, višenitni, srednji zahtjevi za RAM-om Rani primjer kratkog asemblera za čitanje. Ažuriran je za asembliranje transkriptoma.
Trans-ABySS[121] 2010. 2016. Umjereni, višenitni, srednji zahtjevi za RAM memorijom Pogodno za kratka čitanja, može obraditi složene transkriptome, a dostupna je i MPI-paralelni verzija za računarske klastere.
Trojstvo[97][122] 2011. 2017. Umjeren, višenitni, srednji zahtjev za RAM-om Pogodno za kratka čitanja. Može obraditi složene transkriptome, ali intenzivno koristi memoriju.
miraEST[123] 1999. 2016. Umjereni, višenitni, srednji zahtjevi za RAM-om Može obrađivati ponavljajuće sekvence, kombinovati različite formate sekvenciranja i prihvata se širok spektar platformi za sekvenciranje.
Newbler[124] 2004. 2012. Nizak, jednonitni, visoki zahtjevi za RAM memorijom Specijaliziran za prilagođavanje greškama sekvenciranja homopolimera tipičnim za Roche 454 sekvencere.
CLC genomska radna površina [125] 2008. 2014. Visoki, višenitni, niski zahtjevi za RAM memorijom Ima grafički korisnički interfejs, može kombinovati različite tehnologije sekvenciranja, nema karakteristike specifične za transkriptom i licenca se mora kupiti prije upotrebe.
SPAdes[126] 2012. 2017. Visoki, višenitni, niski zahtjevi za RAM memorijom Koristi se za transkriptomske eksperimente na pojedinačnim ćelijama.
RSEM[127] 2011. 2017. Visoki, višenitni, niski zahtjevi za RAM-om Može procijeniti učestalost alternativno spojenih transkripata. Jednostavno za korištenje
StringTie[98][128] 2015. 2019. Visoki, višenitni, niski zahtjevi za RAM memorijom Može se koristiti kombinacija metoda vođenih referencama i de novo metoda asembliranja za identifikaciju transkripata.

Legenda: RAM – memorija sa slučajnim pristupom; MPI – interfejs za prenos poruka; EST – izražena sekvencna oznaka.

Kvantifikacija

[uredi | uredi izvor]
Heatmap identifikacija obrazaca koekspresije gena u različitim uzorcima. Svaka kolona sadrži mjerenja za promjenu ekspresije gena za jedan uzorak. Relativna ekspresija gena je označena bojom: visoka ekspresija (crvena), srednja ekspresija (bijela) i niska ekspresija (plava). Geni i uzorci sa sličnim profilima ekspresije mogu se automatski grupirati (lijevo i gornje stablo). Uzorci mogu biti različite osobe, tkiva, okruženja ili zdravstvena stanja. U ovom primjeru, ekspresija genskog seta 1 je visoka, a ekspresija genskog seta 2 je niska u uzorcima 1, 2 i 3.[51][129]

Kvantifikacija poravnanja sekvenci može se izvršiti na nivou gena, eksona ili transkripta.[87][91] Tipični izlazi uključuju tabelu broja očitavanja za svaku karakteristiku koja se dostavlja softveru; na primjer, za gene u datoteci opći format karakteristika. Broj očitavanja gena i egzona može se prilično lahko izračunati korištenjem HTSeq-a, naprimjer.[130] Kvantifikacija na nivou transkripta je složenija i zahtijeva probabilističke metode za procjenu količine izoformi transkripta iz informacija o kratkom očitavanju; naprimjer, korištenjem softvera za manžetne.[114] Očitavanja koja se podjednako dobro poravnavaju s više lokacija moraju se identificirati i ili ukloniti, poravnati s jednom od mogućih lokacija ili poravnati s najvjerovatnijom lokacijom.

Neki metodi kvantifikacije mogu u potpunosti zaobići potrebu za tačnim poravnanjem očitavanja s referentnom sekvencom. Metod softvera kallisto kombinira pseudoporavnanje i kvantifikaciju u jedan korak koji se izvodi dva reda veličine brže od savremenih metoda poput onih koje koristi softver za tophat/manžetne, s manjim računskim opterećenjem.[131]

Diferencijalna ekspresija

[uredi | uredi izvor]

Nakon što su dostupni kvantitativni podaci o svakom transkriptu, diferencijalna ekspresija gena se mjeri normalizacijom, modeliranjem i statističkom analizom podataka.[108] Većina alata će pročitati tabelu gena i broja očitavanja kao svoj ulaz, ali neki programi, kao što je cuffdiff, će prihvatiti poravnanja očitavanja u formatu binarna mapa poravnanja kao ulaz. Konačni izlazi ovih analiza su liste gena sa pridruženim testovima parova za diferencijalnu ekspresiju između tretmana i procjenama vjerovatnoće tih razlika.[132]

Softver za diferencijalnu ekspresiju gena RNK-Seq
Softver Okruženje Specijalizacija
Cuffdiff2[108] Zasnovano na Unixu Analiza transkripta koja prati alternativno splajsovanje iRNK
EdgeR[93] R/Biokonduktor Bilo koji genomski podaci zasnovani na brojanju
DEseq2[133] R/Biokonduktor Fleksibilni tipovi podataka, niska replikacija
Limma/Voom[92] R/Biokonduktor Podaci mikročipova ili RNK-Seq, fleksibilan dizajn eksperimenta
Ballgown[134] R/Biokonduktor Efikasno i osjetljivo otkrivanje transkripata, fleksibilno.

Legenda: iRNK – informacijska RNK.

Validacija

[uredi | uredi izvor]

Transkriptomske analize mogu se validirati korištenjem nezavisne tehnike, na primjer, kvantitativna PCR (qPCR), koja je prepoznatljiva i statistički procijenjiva.[135] Ekspresija gena se mjeri u odnosu na definirane standarde i za gen od interesa i za kontrolne gene. Mjerenje pomoću qPCR-a slično je onome dobivenom RNK-Seq-om, gdje se vrijednost može izračunati za koncentraciju ciljne regije u datom uzorku. Međutim, qPCR je ograničen na amplikone manje od 300 bp, obično prema 3' kraju kodirajuće regije, izbjegavajući 3'UTR.[136] Ako je potrebna validacija izoformi transkripta, pregled poravnanja RNK-Seq očitavanja trebao bi ukazati gdje bi se qPCR Prajmeri mogu se postaviti za maksimalnu diskriminaciju. Mjerenje više kontrolnih gena zajedno s genima od interesa daje stabilnu referencu unutar biološkog konteksta.[137] qPCR validacija RNK-Seq podataka uglavnom je pokazala da su različiti RNK-Seq metodi visoko korelirane.[62][138][139]

Funkcionalna validacija ključnih gena je važno razmatranje za planiranje nakon transkriptoma. Uočeni obrasci ekspresije gena mogu se funkcionalno povezati sa fenotipom nezavisnom studijom nok-daun/spašavanje u organizmu od interesa.[140]

Aplikacije

[uredi | uredi izvor]

Dijagnostika i profiliranje bolesti

[uredi | uredi izvor]

Transkriptomske strategije su se široko primjenjivale u različitim područjima biomedicinskih istraživanja, uključujući dijagnozu bolesti i profiliranje bolesti.[10][141] RNK-Seq pristupi su omogućili identifikaciju transkripcijskih početnih mjesta velikih razmjera, otkrivenu alternativnu upotrebu promotora i nove promjene u alternativnom splajsovanju. Ovi regulatorni elementi su važni kod ljudskih bolesti i stoga je definiranje takvih varijanti ključno za interpretaciju studija asocijacije na nivou cijelog genoma.[142] RNK-Seq također može identificirati jednonukleotidni polimorfizam (SNP-ove) povezane s bolešću, alel-specifičnu ekspresiju i genske fuzije, što doprinosi razumijevanju uzročnih varijanti bolesti.[143]

Retrotranspozoni su transpozabilni elementi koji se razmnožavaju unutar eukariotskih genoma, procesom koji uključuje reverznu transkripciju. [RNK-Seq može pružiti informacije o transkripciji endogenih retrotranspozona koji mogu uticati na transkripciju susjednih gena putem različitih epigenetičkih mehanizama koji dovode do bolesti.[144] Slično tome, potencijal korištenja RNK-Seq za razumijevanje bolesti povezanih s imunskim sistemom se brzo širi zbog mogućnosti disekcije populacija imunskih ćelija i sekvenciranja T-ćelija i B ćelijskih receptora repertoara pacijenata.[145][146]

Transkriptomi ljudi i patogena

[uredi | uredi izvor]

RNK-Seq ljudskih patogena postao je utvrđeni metod za kvantificiranje promjena u ekspresiji gena, identifikaciju novih faktora virulencije, predviđanje otpornosti na antibiotike i otkrivanje interakcije domaćina i patogena.[147][148] Primarni cilj ove tehnologije je razvoj optimiziranih mjera kontrola infekcije i ciljanog individualiziranog tretmana.

Transkriptomska analiza se pretežno fokusirala ili na domaćina ili na patogen. Dvostruko RNK-Seq je primijenjeno za istovremeno profiliranje ekspresije RNK i u patogenu i u domaćinu tokom cijelog procesa infekcije. Ova tehnika omogućava proučavanje dinamičkog odgovora i međuvrsnih mreža regulatornih gena kod oba partnera u interakciji od početnog kontakta do invazije i konačne perzistencije patogena ili uklanjanja od strane imunskog sistema domaćina.[149][150]

Reakcije na okolinu

[uredi | uredi izvor]

Transkriptomika omogućava identifikaciju gena i puteva koji reaguju na i suzbijaju biotički i abiotičke stresove okoline[140][151] Neciljana priroda transkriptomike omogućava identifikaciju novih transkripcijskih mreža u složenim sistemima. Naprimjer, komparativna analiza niza linija slanutka u različitim razvojnim fazama identificirala je različite transkripcijske profile povezane sa stresom suše i slanosti, uključujući identifikaciju uloge alternativnog splajsovanja izoformi transkripta AP2-EREBP.[151] Ispitivanje ekspresija gena tokom formiranja biofilma od strane gljivičnog patogena Candida albicans otkrilo je koregulirani skup gena ključnih za uspostavljanje i održavanje biofilma.[152]

Transkriptomsko profiliranje također pruža ključne informacije o mehanizmima otpornosti na lijekove. Analiza preko 1000 izolata Plasmodium falciparum, virulentnog parazita odgovornog za malariju kod ljudis,[153] identificirali su da su pojačana regulacija odgovora na nesavijeni protein i sporije napredovanje kroz rane faze aseksualnog intraeritrocitnog razvojni ciklus povezani s rezistencijom na artemizinin u izolatima iz Jugoistočne Azije.[154]

Upotreba transkriptomike je također važna za istraživanje odgovora u morskom okruženju.[155] U morskoj ekologiji, "stres" i "adaptacija" su među najčešćim istraživačkim temama, posebno vezanim za antropogeni stres, kao što su globalne promjene i zagađenje.[155] Većina studija u ovom području provedena je na životinjama, iako su beskičmenjaci bili nedovoljno zastupljeni.[155] Jedan problem i dalje predstavlja nedostatak u funkcionalnim genetičkim studijama, što otežava anotaciju gena, posebno za vrste koje nisu modelne, i može dovesti do nejasnih zaključaka o efektima proučavanih odgovora.[155]

Anotacija funkcije gena

[uredi | uredi izvor]

Sve transkriptomske tehnike su bile posebno korisne u anotaciji funkcije gena i identificiranju onih odgovornih za određene fenotipove. Transkriptomika ekotipa Arabidopsis koji hiperakumuliraju metale korelira gene uključene u bio[[neorganska hemija|Transport i skladištenje metalnih iona i apsorpciju metala, toleranciju i homeostazu sa fenotipom.[156] Integracija RNK-Seq skupova podataka u različitim tkivima korištena je za poboljšanje anotacije genskih funkcija kod komercijalno važnih organizama (npr. krastavac[157] ili ugrožene vrste (npr. koala).[158]

Sklapanje RNK-Seq očitavanja ne zavisi od referentnog genoma[122] i stoga je idealan za studije ekspresije gena nemodelnih organizama s nepostojećim ili slabo razvijenim genomskim resursima. Naprimjer, baza podataka SNP-ova korištenih u programima oplemenjivanja duglasova jela kreirana je de novo analizom transkriptoma u odsustvu sekvenciranog genoma.[159] Slično tome, geni koji funkcionišu u razvoju srčanog, mišićnog i nervnog tkiva kod jastoga identifikovani su poređenjem transkriptoma različitih tipova tkiva bez upotrebe genomske sekvence.[160] RNK-Seq se također može koristiti za identifikaciju prethodno nepoznatih regija koja kodira protein u postojećim sekvenciranim genomima.

Nekodirajuća RNK

[uredi | uredi izvor]

Transkriptomika se najčešće primjenjuje na sadržaj iRNK u ćeliji. Međutim, iste tehnike su podjednako primjenjive na nekodirajuće RNK (ncRNK) koje se ne translatiraju u protein, već imaju direktne funkcije (npr. uloge u translaciji proteina, replikaciji DNK, splajsovanju RNK i regulaciji transkripcije).[161][162][163][164] Mnoge od ovih ncRNK utiču na bolesna stanja, uključujući kancer, kardiovaskularne i neurološke bolesti.[165]

Transkriptomske baze podataka

[uredi | uredi izvor]

Transkriptomske studije generiraju velike količine podataka koji imaju potencijalne primjene daleko izvan prvobitnih ciljeva eksperimenta. Kao takvi, sirovi ili obrađeni podaci mogu se pohraniti u javne baze podataka kako bi se osigurala njihova korisnost za širu naučnu zajednicu. Naprimjer, od 2018. godine, Gene Expression Omnibus sadržavao je milione eksperimenata.[166]

Poređenje suvremenih metoda[10][23][24]
RNK-Seq Mikročip
Protok 1 dan do 1 sedmica po eksperimentu[10] 1–2 dana po eksperimentu[10]
Unesena količina RNK Niska ~ 1 ng ukupna RNK[25] Visoka ~ 1 μg mRNA[26]
Intenzitet rada Visok (priprema uzorka i analiza podataka)[10][23] Nizak[10][23]
Prethodno znanje Nije potrebno, iako je referentna sekvenca genoma/transkriptoma korisna[23] Referentni genom/transkriptom je potreban za dizajn sondi[23]
Tačnost kvantifikacije ~90%(ograničeno pokrivenošću sekvence)[27] >90% (ograničeno tačnošću detekcije fluorescencija)[27]
Rezolucija sekvence RNK-Seq može detektovati SNP-ove i varijante splajsovanja (ograničeno tačnošću sekvenciranja od ~99%)[27] Specijalizovani nizovi mogu detektovati varijante splajsovanja iRNK (ograničeno dizajnom sonde i unakrsnom hibridizacijom)[27]
Osjetljivost 1 transkript na milion (približno, ograničeno pokrivenošću sekvence)[27] 1 transkript na hiljadu (približno, ograničeno detekcijom fluorescencija)[27]
Dinamički raspon 100.000:1 (ograničeno pokrivenošću sekvence)[28] 1.000:1 (ograničeno zasićenjem fluorescencija)[28]
Tehnička reproducibilnost >99%[29][30] >99%[31][32]

Legenda: NCBI – Nacionalni centar za biotehnološke informacije; EBI – Evropski bioinformatički institut; DDBJ – Banka podataka DNK Japana; ENA – Evropski arhiv nukleotida; MIAME – Minimalne informacije o eksperimentu mikročipova; MINSEQE – Minimalne informacije o eksperimentu sekvenciranja nukleotida visokog protoka.

Također pogledajte

[uredi | uredi izvor]

Reference

[uredi | uredi izvor]

Ovaj članak je adaptiran iz sljedećeg izvora pod Šablon:GetLicense licenca (Greška: vrijeme nije valjano Greška: vrijeme nije valjano) (reviewer reports): Rohan Lowe; Neil Shirley; Mark Bleackley; Stephen Dolan; Thomas Shafee (18 maj 2017). "Transcriptomics technologies". PLOS Computational Biology (jezik: engleski). 13 (5). doi:10.1371/JOURNAL.PCBI.1005457. ISSN 1553-734X. PMC 5436640. PMID 28545146. S2CID 3714586. Wikipodaci Q33703532. Greška: Imena pokazatelja stanja stranice ne smiju biti prazna.

  1. ↑ "Medline trend: automated yearly statistics of PubMed results for any query". dan.corlan.net. Pristupljeno 5. 10. 2016.
  2. 1 2 Adams MD, Kelley JM, Gocayne JD, Dubnick M, Polymeropoulos MH, Xiao H, et al. (juni 1991). "Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project". Science. 252 (5013): 1651–6. Bibcode:1991Sci...252.1651A. doi:10.1126/science.2047873. PMID 2047873. S2CID 13436211.
  3. ↑ Pan Q, Shai O, Lee LJ, Frey BJ, Blencowe BJ (decembar 2008). "Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing". Nature Genetics. 40 (12): 1413–5. doi:10.1038/ng.259. PMID 18978789. S2CID 9228930.
  4. 1 2 Sultan M, Schulz MH, Richard H, Magen A, Klingenhoff A, Scherf M, et al. (august 2008). "A global view of gene activity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcriptome". Science. 321 (5891): 956–60. Bibcode:2008Sci...321..956S. doi:10.1126/science.1160342. PMID 18599741. S2CID 10013179.
  5. ↑ Lappalainen T, Sammeth M, Friedländer MR, 't Hoen PA, Monlong J, Rivas MA, et al. (septembar 2013). "Transcriptome and genome sequencing uncovers functional variation in humans". Nature. 501 (7468): 506–11. Bibcode:2013Natur.501..506L. doi:10.1038/nature12531. PMC 3918453. PMID 24037378.
  6. 1 2 Melé M, Ferreira PG, Reverter F, DeLuca DS, Monlong J, Sammeth M, et al. (maj 2015). "Human genomics. The human transcriptome across tissues and individuals". Science. 348 (6235): 660–5. Bibcode:2015Sci...348..660M. doi:10.1126/science.aaa0355. PMC 4547472. PMID 25954002.
  7. ↑ Sandberg R (januar 2014). "Entering the era of single-cell transcriptomics in biology and medicine". Nature Methods. 11 (1): 22–4. doi:10.1038/nmeth.2764. PMID 24524133. S2CID 27632439.
  8. ↑ Kolodziejczyk AA, Kim JK, Svensson V, Marioni JC, Teichmann SA (maj 2015). "The technology and biology of single-cell RNA sequencing". Molecular Cell. 58 (4): 610–20. doi:10.1016/j.molcel.2015.04.005. PMID 26000846.
  9. 1 2 3 4 McGettigan PA (februar 2013). "Transcriptomics in the RNA-seq era". Current Opinion in Chemical Biology. 17 (1): 4–11. doi:10.1016/j.cbpa.2012.12.008. PMID 23290152.
  10. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Wang Z, Gerstein M, Snyder M (januar 2009). "RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics". Nature Reviews Genetics. 10 (1): 57–63. doi:10.1038/nrg2484. PMC 2949280. PMID 19015660.
  11. 1 2 3 Ozsolak F, Milos PM (februar 2011). "RNA sequencing: advances, challenges and opportunities". Nature Reviews Genetics. 12 (2): 87–98. doi:10.1038/nrg2934. PMC 3031867. PMID 21191423.
  12. 1 2 Morozova O, Hirst M, Marra MA (2009). "Applications of new sequencing technologies for transcriptome analysis". Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10: 135–51. doi:10.1146/annurev-genom-082908-145957. PMID 19715439.
  13. ↑ Sim GK, Kafatos FC, Jones CW, Koehler MD, Efstratiadis A, Maniatis T (decembar 1979). "Use of a cDNA library for studies on evolution and developmental expression of the chorion multigene families". Cell. 18 (4): 1303–16. doi:10.1016/0092-8674(79)90241-1. PMID 519770.
  14. ↑ Sutcliffe JG, Milner RJ, Bloom FE, Lerner RA (august 1982). "Common 82-nucleotide sequence unique to brain RNA". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (16): 4942–6. Bibcode:1982PNAS...79.4942S. doi:10.1073/pnas.79.16.4942. PMC 346801. PMID 6956902.
  15. ↑ Putney SD, Herlihy WC, Schimmel P (april 1983). "A new troponin T and cDNA clones for 13 different muscle proteins, found by shotgun sequencing". Nature. 302 (5910): 718–21. Bibcode:1983Natur.302..718P. doi:10.1038/302718a0. PMID 6687628. S2CID 4364361.
  16. 1 2 3 4 Marra MA, Hillier L, Waterston RH (januar 1998). "Expressed sequence tags—ESTablishing bridges between genomes". Trends in Genetics. 14 (1): 4–7. doi:10.1016/S0168-9525(97)01355-3. PMID 9448457.
  17. ↑ Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (decembar 1977). "Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12): 5350–4. Bibcode:1977PNAS...74.5350A. doi:10.1073/pnas.74.12.5350. PMC 431715. PMID 414220.
  18. ↑ Becker-André M, Hahlbrock K (novembar 1989). "Absolute mRNA quantification using the polymerase chain reaction (PCR). A novel approach by a PCR aided transcript titration assay (PATTY)". Nucleic Acids Research. 17 (22): 9437–46. doi:10.1093/nar/17.22.9437. PMC 335144. PMID 2479917.
  19. ↑ Piétu G, Mariage-Samson R, Fayein NA, Matingou C, Eveno E, Houlgatte R, Decraene C, Vandenbrouck Y, Tahi F, Devignes MD, Wirkner U, Ansorge W, Cox D, Nagase T, Nomura N, Auffray C (februar 1999). "The Genexpress IMAGE knowledge base of the human brain transcriptome: a prototype integrated resource for functional and computational genomics". Genome Research. 9 (2): 195–209. doi:10.1101/gr.9.2.195. PMC 310711. PMID 10022985.
  20. ↑ Velculescu VE, Zhang L, Zhou W, Vogelstein J, Basrai MA, Bassett DE, Hieter P, Vogelstein B, Kinzler KW (januar 1997). "Characterization of the yeast transcriptome". Cell. 88 (2): 243–51. doi:10.1016/S0092-8674(00)81845-0. PMID 9008165. S2CID 11430660.
  21. 1 2 3 4 Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW (oktobar 1995). "Serial analysis of gene expression". Science. 270 (5235): 484–7. Bibcode:1995Sci...270..484V. doi:10.1126/science.270.5235.484. PMID 7570003. S2CID 16281846.
  22. ↑ Audic S, Claverie JM (oktobar 1997). "The significance of digital gene expression profiles". Genome Research. 7 (10): 986–95. doi:10.1101/gr.7.10.986. PMID 9331369.
  23. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Mantione KJ, Kream RM, Kuzelova H, Ptacek R, Raboch J, Samuel JM, Stefano GB (august 2014). "Comparing bioinformatic gene expression profiling methods: microarray and RNA-Seq". Medical Science Monitor Basic Research. 20: 138–42. doi:10.12659/MSMBR.892101. PMC 4152252. PMID 25149683.
  24. 1 2 Zhao S, Fung-Leung WP, Bittner A, Ngo K, Liu X (2014). "Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells". PLOS ONE. 9 (1): e78644. Bibcode:2014PLoSO...978644Z. doi:10.1371/journal.pone.0078644. PMC 3894192. PMID 24454679.
  25. 1 2 3 Hashimshony T, Wagner F, Sher N, Yanai I (septembar 2012). "CEL-Seq: single-cell RNA-Seq by multiplexed linear amplification". Cell Reports. 2 (3): 666–73. doi:10.1016/j.celrep.2012.08.003. PMID 22939981.
  26. 1 2 Stears RL, Getts RC, Gullans SR (august 2000). "A novel, sensitive detection system for high-density microarrays using dendrimer technology". Physiological Genomics. 3 (2): 93–9. doi:10.1152/physiolgenomics.2000.3.2.93. PMID 11015604.
  27. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Illumina (11. 7. 2011). "RNA-Seq Data Comparison with Gene Expression Microarrays" (PDF). European Pharmaceutical Review.
  28. 1 2 3 4 Black MB, Parks BB, Pluta L, Chu TM, Allen BC, Wolfinger RD, Thomas RS (februar 2014). "Comparison of microarrays and RNA-seq for gene expression analyses of dose-response experiments". Toxicological Sciences. 137 (2): 385–403. doi:10.1093/toxsci/kft249. PMID 24194394.
  29. 1 2 Marioni JC, Mason CE, Mane SM, Stephens M, Gilad Y (septembar 2008). "RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays". Genome Research. 18 (9): 1509–17. doi:10.1101/gr.079558.108. PMC 2527709. PMID 18550803.
  30. 1 2 SEQC/MAQC-III Consortium (septembar 2014). "A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium". Nature Biotechnology. 32 (9): 903–14. doi:10.1038/nbt.2957. PMC 4321899. PMID 25150838. Greška kod citiranja: Neispravna oznaka <ref>; naziv "#25150838" definiran je nekoliko puta s različitim sadržajem
  31. 1 2 Chen JJ, Hsueh HM, Delongchamp RR, Lin CJ, Tsai CA (oktobar 2007). "Reproducibility of microarray data: a further analysis of microarray quality control (MAQC) data". BMC Bioinformatics. 8. doi:10.1186/1471-2105-8-412. PMC 2204045. PMID 17961233. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  32. 1 2 Larkin JE, Frank BC, Gavras H, Sultana R, Quackenbush J (maj 2005). "Independence and reproducibility across microarray platforms". Nature Methods. 2 (5): 337–44. doi:10.1038/nmeth757. PMID 15846360. S2CID 16088782.
  33. 1 2 Nelson NJ (april 2001). "Microarrays have arrived: gene expression tool matures". Journal of the National Cancer Institute. 93 (7): 492–4. doi:10.1093/jnci/93.7.492. PMID 11287436.
  34. ↑ Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO (oktobar 1995). "Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray". Science. 270 (5235): 467–70. Bibcode:1995Sci...270..467S. doi:10.1126/science.270.5235.467. PMID 7569999. S2CID 6720459.
  35. 1 2 Pozhitkov AE, Tautz D, Noble PA (juni 2007). "Oligonucleotide microarrays: widely applied—poorly understood". Briefings in Functional Genomics & Proteomics. 6 (2): 141–8. doi:10.1093/bfgp/elm014. hdl:11858/00-001M-0000-000F-D7B3-3. PMID 17644526.
  36. 1 2 3 Heller MJ (2002). "DNA microarray technology: devices, systems, and applications". Annual Review of Biomedical Engineering. 4: 129–53. doi:10.1146/annurev.bioeng.4.020702.153438. PMID 12117754.
  37. ↑ McLachlan GJ, Do K, Ambroise C (2005). Analyzing Microarray Gene Expression Data. Hoboken: John Wiley & Sons. ISBN 978-0-471-72612-8.[potrebna stranica]
  38. ↑ Brenner S, Johnson M, Bridgham J, Golda G, Lloyd DH, Johnson D, Luo S, McCurdy S, Foy M, Ewan M, Roth R, George D, Eletr S, Albrecht G, Vermaas E, Williams SR, Moon K, Burcham T, Pallas M, DuBridge RB, Kirchner J, Fearon K, Mao J, Corcoran K (juni 2000). "Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays". Nature Biotechnology. 18 (6): 630–4. doi:10.1038/76469. PMID 10835600. S2CID 13884154.
  39. ↑ Meyers BC, Vu TH, Tej SS, Ghazal H, Matvienko M, Agrawal V, Ning J, Haudenschild CD (august 2004). "Analysis of the transcriptional complexity of Arabidopsis thaliana by massively parallel signature sequencing". Nature Biotechnology. 22 (8): 1006–11. doi:10.1038/nbt992. PMID 15247925. S2CID 15336496.
  40. 1 2 Bainbridge MN, Warren RL, Hirst M, Romanuik T, Zeng T, Go A, Delaney A, Griffith M, Hickenbotham M, Magrini V, Mardis ER, Sadar MD, Siddiqui AS, Marra MA, Jones SJ (septembar 2006). "Analysis of the prostate cancer cell line LNCaP transcriptome using a sequencing-by-synthesis approach". BMC Genomics. 7. doi:10.1186/1471-2164-7-246. PMC 1592491. PMID 17010196. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  41. ↑ Mortazavi A, Williams BA, McCue K, Schaeffer L, Wold B (juli 2008). "Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq". Nature Methods. 5 (7): 621–8. doi:10.1038/nmeth.1226. PMID 18516045. S2CID 205418589.
  42. ↑ Wilhelm BT, Marguerat S, Watt S, Schubert F, Wood V, Goodhead I, Penkett CJ, Rogers J, Bähler J (juni 2008). "Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution". Nature. 453 (7199): 1239–43. Bibcode:2008Natur.453.1239W. doi:10.1038/nature07002. PMID 18488015. S2CID 205213499.
  43. ↑ Sultan M, Schulz MH, Richard H, Magen A, Klingenhoff A, Scherf M, Seifert M, Borodina T, Soldatov A, Parkhomchuk D, Schmidt D, O'Keeffe S, Haas S, Vingron M, Lehrach H, Yaspo ML (august 2008). "A global view of gene activity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcriptome". Science. 321 (5891): 956–60. Bibcode:2008Sci...321..956S. doi:10.1126/science.1160342. PMID 18599741. S2CID 10013179.
  44. 1 2 Chomczynski P, Sacchi N (april 1987). "Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction". Analytical Biochemistry. 162 (1): 156–9. doi:10.1016/0003-2697(87)90021-2. PMID 2440339.
  45. 1 2 Chomczynski P, Sacchi N (2006). "The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on". Nature Protocols. 1 (2): 581–5. doi:10.1038/nprot.2006.83. PMID 17406285. S2CID 28653075.
  46. ↑ Grillo M, Margolis FL (septembar 1990). "Use of reverse transcriptase polymerase chain reaction to monitor expression of intronless genes". BioTechniques. 9 (3): 262, 264, 266–8. PMID 1699561.
  47. ↑ Bryant S, Manning DL (1998). "Isolation of messenger RNA". RNA Isolation and Characterization Protocols. Methods in Molecular Biology. 86. str. 61–4. doi:10.1385/0-89603-494-1:61. ISBN 978-0-89603-494-5. PMID 9664454.
  48. ↑ Zhao W, He X, Hoadley KA, Parker JS, Hayes DN, Perou CM (juni 2014). "Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling". BMC Genomics. 15 (1). doi:10.1186/1471-2164-15-419. PMC 4070569. PMID 24888378. Navedeno je više parametara |number= i |issue= (pomoć)
  49. ↑ Neki primjeri uzoraka iz okoliša uključuju: morsku vodu, tlo ili zrak.
  50. ↑ Close TJ, Wanamaker SI, Caldo RA, Turner SM, Ashlock DA, Dickerson JA, Wing RA, Muehlbauer GJ, Kleinhofs A, Wise RP (mart 2004). "A new resource for cereal genomics: 22K barley GeneChip comes of age". Plant Physiology. 134 (3): 960–8. doi:10.1104/pp.103.034462. PMC 389919. PMID 15020760.
  51. 1 2 3 4 5 Lowe R, Shirley N, Bleackley M, Dolan S, Shafee T (maj 2017). "Transcriptomics technologies". PLOS Computational Biology. 13 (5): e1005457. Bibcode:2017PLSCB..13E5457L. doi:10.1371/journal.pcbi.1005457. PMC 5436640. PMID 28545146.
  52. 1 2 Shiraki T, Kondo S, Katayama S, Waki K, Kasukawa T, Kawaji H, Kodzius R, Watahiki A, Nakamura M, Arakawa T, Fukuda S, Sasaki D, Podhajska A, Harbers M, Kawai J, Carninci P, Hayashizaki Y (decembar 2003). "Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26): 15776–81. Bibcode:2003PNAS..10015776S. doi:10.1073/pnas.2136655100. PMC 307644. PMID 14663149.
  53. ↑ Romanov V, Davidoff SN, Miles AR, Grainger DW, Gale BK, Brooks BD (mart 2014). "A critical comparison of protein microarray fabrication technologies". The Analyst. 139 (6): 1303–26. Bibcode:2014Ana...139.1303R. doi:10.1039/c3an01577g. PMID 24479125.
  54. 1 2 Barbulovic-Nad I, Lucente M, Sun Y, Zhang M, Wheeler AR, Bussmann M (1. 10. 2006). "Bio-microarray fabrication techniques—a review". Critical Reviews in Biotechnology. 26 (4): 237–59. CiteSeerX 10.1.1.661.6833. doi:10.1080/07388550600978358. PMID 17095434. S2CID 13712888.
  55. ↑ Auburn RP, Kreil DP, Meadows LA, Fischer B, Matilla SS, Russell S (juli 2005). "Robotic spotting of cDNA and oligonucleotide microarrays". Trends in Biotechnology. 23 (7): 374–9. doi:10.1016/j.tibtech.2005.04.002. PMID 15978318.
  56. ↑ Shalon D, Smith SJ, Brown PO (juli 1996). "A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization". Genome Research. 6 (7): 639–45. doi:10.1101/gr.6.7.639. PMID 8796352.
  57. ↑ Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Follettie MT, Gallo MV, Chee MS, Mittmann M, Wang C, Kobayashi M, Horton H, Brown EL (decembar 1996). "Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays". Nature Biotechnology. 14 (13): 1675–80. doi:10.1038/nbt1296-1675. PMID 9634850. S2CID 35232673.
  58. ↑ Irizarry RA, Bolstad BM, Collin F, Cope LM, Hobbs B, Speed TP (februar 2003). "Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data". Nucleic Acids Research. 31 (4): 15e–15. doi:10.1093/nar/gng015. PMC 150247. PMID 12582260.
  59. ↑ Selzer RR, Richmond TA, Pofahl NJ, Green RD, Eis PS, Nair P, Brothman AR, Stallings RL (novembar 2005). "Analysis of chromosome breakpoints in neuroblastoma at sub-kilobase resolution using fine-tiling oligonucleotide array CGH". Genes, Chromosomes & Cancer. 44 (3): 305–19. doi:10.1002/gcc.20243. PMID 16075461. S2CID 39437458.
  60. ↑ Svensson V, Vento-Tormo R, Teichmann SA (april 2018). "Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade". Nature Protocols. 13 (4): 599–604. doi:10.1038/nprot.2017.149. PMID 29494575. S2CID 3560001.
  61. ↑ Tachibana C (18. 8. 2015). "Transcriptomics today: Microarrays, RNA-seq, and more". Science. 349 (6247): 544. Bibcode:2015Sci...349..544T. doi:10.1126/science.opms.p1500095.
  62. 1 2 Nagalakshmi U, Wang Z, Waern K, Shou C, Raha D, Gerstein M, Snyder M (juni 2008). "The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing". Science. 320 (5881): 1344–9. Bibcode:2008Sci...320.1344N. doi:10.1126/science.1158441. PMC 2951732. PMID 18451266.
  63. ↑ Su Z, Fang H, Hong H, Shi L, Zhang W, Zhang W, Zhang Y, Dong Z, Lancashire LJ, Bessarabova M, Yang X, Ning B, Gong B, Meehan J, Xu J, Ge W, Perkins R, Fischer M, Tong W (decembar 2014). "An investigation of biomarkers derived from legacy microarray data for their utility in the RNA-seq era". Genome Biology. 15 (12). doi:10.1186/s13059-014-0523-y. PMC 4290828. PMID 25633159. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  64. ↑ Lee JH, Daugharthy ER, Scheiman J, Kalhor R, Yang JL, Ferrante TC, Terry R, Jeanty SS, Li C, Amamoto R, Peters DT, Turczyk BM, Marblestone AH, Inverso SA, Bernard A, Mali P, Rios X, Aach J, Church GM (mart 2014). "Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ". Science. 343 (6177): 1360–3. Bibcode:2014Sci...343.1360L. doi:10.1126/science.1250212. PMC 4140943. PMID 24578530.
  65. 1 2 Shendure J, Ji H (oktobar 2008). "Next-generation DNA sequencing". Nature Biotechnology. 26 (10): 1135–45. doi:10.1038/nbt1486. PMID 18846087. S2CID 6384349.
  66. ↑ Lahens NF, Kavakli IH, Zhang R, Hayer K, Black MB, Dueck H, Pizarro A, Kim J, Irizarry R, Thomas RS, Grant GR, Hogenesch JB (juni 2014). "IVT-seq reveals extreme bias in RNA sequencing". Genome Biology. 15 (6). doi:10.1186/gb-2014-15-6-r86. PMC 4197826. PMID 24981968. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  67. 1 2 Knierim E, Lucke B, Schwarz JM, Schuelke M, Seelow D (2011). "Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing". PLOS ONE. 6 (11): e28240. Bibcode:2011PLoSO...628240K. doi:10.1371/journal.pone.0028240. PMC 3227650. PMID 22140562.
  68. ↑ Routh A, Head SR, Ordoukhanian P, Johnson JE (august 2015). "ClickSeq: Fragmentation-Free Next-Generation Sequencing via Click Ligation of Adaptors to Stochastically Terminated 3'-Azido cDNAs". Journal of Molecular Biology. 427 (16): 2610–6. doi:10.1016/j.jmb.2015.06.011. PMC 4523409. PMID 26116762.
  69. ↑ Parekh S, Ziegenhain C, Vieth B, Enard W, Hellmann I (maj 2016). "The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq". Scientific Reports. 6. Bibcode:2016NatSR...625533P. doi:10.1038/srep25533. PMC 4860583. PMID 27156886. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  70. ↑ Shanker S, Paulson A, Edenberg HJ, Peak A, Perera A, Alekseyev YO, Beckloff N, Bivens NJ, Donnelly R, Gillaspy AF, Grove D, Gu W, Jafari N, Kerley-Hamilton JS, Lyons RH, Tepper C, Nicolet CM (april 2015). "Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA". Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1): 4–18. doi:10.7171/jbt.15-2601-001. PMC 4310221. PMID 25649271.
  71. ↑ Jiang L, Schlesinger F, Davis CA, Zhang Y, Li R, Salit M, Gingeras TR, Oliver B (septembar 2011). "Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments". Genome Research. 21 (9): 1543–51. doi:10.1101/gr.121095.111. PMC 3166838. PMID 21816910.
  72. ↑ Kivioja T, Vähärautio A, Karlsson K, Bonke M, Enge M, Linnarsson S, Taipale J (novembar 2011). "Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers". Nature Methods. 9 (1): 72–4. doi:10.1038/nmeth.1778. PMID 22101854. S2CID 39225091.
  73. ↑ Tang F, Barbacioru C, Wang Y, Nordman E, Lee C, Xu N, Wang X, Bodeau J, Tuch BB, Siddiqui A, Lao K, Surani MA (maj 2009). "mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell". Nature Methods. 6 (5): 377–82. doi:10.1038/nmeth.1315. PMID 19349980. S2CID 16570747.
  74. ↑ Islam S, Zeisel A, Joost S, La Manno G, Zajac P, Kasper M, Lönnerberg P, Linnarsson S (februar 2014). "Quantitative single-cell RNA-seq with unique molecular identifiers". Nature Methods. 11 (2): 163–6. doi:10.1038/nmeth.2772. PMID 24363023. S2CID 6765530.
  75. ↑ Jaitin DA, Kenigsberg E, Keren-Shaul H, Elefant N, Paul F, Zaretsky I, Mildner A, Cohen N, Jung S, Tanay A, Amit I (februar 2014). "Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types". Science. 343 (6172): 776–9. Bibcode:2014Sci...343..776J. doi:10.1126/science.1247651. PMC 4412462. PMID 24531970.
  76. 1 2 Levin JZ, Yassour M, Adiconis X, Nusbaum C, Thompson DA, Friedman N, Gnirke A, Regev A (septembar 2010). "Comprehensive comparative analysis of strand-specific RNA sequencing methods". Nature Methods. 7 (9): 709–15. doi:10.1038/nmeth.1491. PMC 3005310. PMID 20711195.
  77. ↑ Quail MA, Smith M, Coupland P, Otto TD, Harris SR, Connor TR, Bertoni A, Swerdlow HP, Gu Y (juli 2012). "A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers". BMC Genomics. 13: 341. doi:10.1186/1471-2164-13-341. PMC 3431227. PMID 22827831.
  78. 1 2 Liu L, Li Y, Li S, Hu N, He Y, Pong R, Lin D, Lu L, Law M (2012). "Comparison of next-generation sequencing systems". Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012: 251364. doi:10.1155/2012/251364. PMC 3398667. PMID 22829749.
  79. ↑ "SRA". Pristupljeno 6. 10. 2016.The NCBI Sequence Read Archive (SRA) was searched using “RNA-Seq[Strategy]” and one of "LS454[Platform]”, “Illumina[platform]”, "ABI Solid[Platform]”, "Ion Torrent[Platform]”, "PacBio SMRT"[Platform]” to report the number of RNA-Seq runs deposited for each platform.
  80. ↑ Loman NJ, Misra RV, Dallman TJ, Constantinidou C, Gharbia SE, Wain J, Pallen MJ (maj 2012). "Performance comparison of benchtop high-throughput sequencing platforms". Nature Biotechnology. 30 (5): 434–9. doi:10.1038/nbt.2198. PMID 22522955. S2CID 5300923.
  81. ↑ Goodwin S, McPherson JD, McCombie WR (maj 2016). "Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies". Nature Reviews Genetics. 17 (6): 333–51. doi:10.1038/nrg.2016.49. PMC 10373632 Provjerite vrijednost parametra |pmc= (pomoć). PMID 27184599. S2CID 8295541.
  82. ↑ Garalde DR, Snell EA, Jachimowicz D, Sipos B, Lloyd JH, Bruce M, Pantic N, Admassu T, James P, Warland A, Jordan M, Ciccone J, Serra S, Keenan J, Martin S, McNeill L, Wallace EJ, Jayasinghe L, Wright C, Blasco J, Young S, Brocklebank D, Juul S, Clarke J, Heron AJ, Turner DJ (mart 2018). "Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores". Nature Methods (jezik: engleski). 15 (3): 201–206. doi:10.1038/nmeth.4577. PMID 29334379. S2CID 3589823.
  83. ↑ Loman NJ, Quick J, Simpson JT (august 2015). "A complete bacterial genome assembled de novo using only nanopore sequencing data". Nature Methods. 12 (8): 733–5. doi:10.1038/nmeth.3444. PMID 26076426. S2CID 15053702.
  84. ↑ Ozsolak F, Platt AR, Jones DR, Reifenberger JG, Sass LE, McInerney P, Thompson JF, Bowers J, Jarosz M, Milos PM (oktobar 2009). "Direct RNA sequencing". Nature. 461 (7265): 814–8. Bibcode:2009Natur.461..814O. doi:10.1038/nature08390. PMID 19776739. S2CID 4426760.
  85. 1 2 Hart SN, Therneau TM, Zhang Y, Poland GA, Kocher JP (decembar 2013). "Calculating sample size estimates for RNA sequencing data". Journal of Computational Biology. 20 (12): 970–8. doi:10.1089/cmb.2012.0283. PMC 3842884. PMID 23961961.
  86. 1 2 3 Conesa A, Madrigal P, Tarazona S, Gomez-Cabrero D, Cervera A, McPherson A, Szcześniak MW, Gaffney DJ, Elo LL, Zhang X, Mortazavi A (januar 2016). "A survey of best practices for RNA-seq data analysis". Genome Biology. 17. doi:10.1186/s13059-016-0881-8. PMC 4728800. PMID 26813401. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  87. 1 2 Rapaport F, Khanin R, Liang Y, Pirun M, Krek A, Zumbo P, Mason CE, Socci ND, Betel D (2013). "Comprehensive evaluation of differential gene expression analysis methods for RNA-seq data". Genome Biology. 14 (9): R95. doi:10.1186/gb-2013-14-9-r95. PMC 4054597. PMID 24020486. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  88. ↑ ENCODE Project Consortium; Aldred, Shelley F.; Collins, Patrick J.; Davis, Carrie A.; Doyle, Francis; Epstein, Charles B.; Frietze, Seth; Harrow, Jennifer; Kaul, Rajinder; Khatun, Jainab; Lajoie, Bryan R.; Landt, Stephen G.; Lee, Bum-Kyu; Pauli, Florencia; Rosenbloom, Kate R.; Sabo, Peter; Safi, Alexias; Sanyal, Amartya; Shoresh, Noam; Simon, Jeremy M.; Song, Lingyun; Altshuler, Robert C.; Birney, Ewan; Brown, James B.; Cheng, Chao; Djebali, Sarah; Dong, Xianjun; Dunham, Ian; Ernst, Jason; et al. (septembar 2012). "An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome". Nature. 489 (7414): 57–74. Bibcode:2012Natur.489...57T. doi:10.1038/nature11247. PMC 3439153. PMID 22955616.
  89. ↑ Sloan CA, Chan ET, Davidson JM, Malladi VS, Strattan JS, Hitz BC, et al. (januar 2016). "ENCODE data at the ENCODE portal". Nucleic Acids Research. 44 (D1): D726–32. doi:10.1093/nar/gkv1160. PMC 4702836. PMID 26527727.
  90. ↑ "ENCODE: Encyclopedia of DNA Elements". encodeproject.org.
  91. 1 2 Thind AS, Monga I, Thakur PK, Kumari P, Dindhoria K, Krzak M, Ranson M, Ashford B (Nov 2021). "Demystifying emerging bulk RNA-Seq applications: the application and utility of bioinformatic methodology". Briefings in Bioinformatics. 22 (6). doi:10.1093/bib/bbab259. PMID 34329375 Provjerite vrijednost parametra |pmid= (pomoć).
  92. 1 2 Ritchie ME, Phipson B, Wu D, Hu Y, Law CW, Shi W, Smyth GK (april 2015). "limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies". Nucleic Acids Research. 43 (7): e47. doi:10.1093/nar/gkv007. PMC 4402510. PMID 25605792.
  93. 1 2 Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK (januar 2010). "edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data". Bioinformatics. 26 (1): 139–40. doi:10.1093/bioinformatics/btp616. PMC 2796818. PMID 19910308.
  94. 1 2 Huber W, Carey VJ, Gentleman R, Anders S, Carlson M, Carvalho BS, et al. (februar 2015). "Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor". Nature Methods. 12 (2): 115–21. doi:10.1038/nmeth.3252. PMC 4509590. PMID 25633503.
  95. ↑ Smyth, G. K. (2005). "Limma: Linear Models for Microarray Data". Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. Statistics for Biology and Health (jezik: engleski). Springer, New York, NY. str. 397–420. CiteSeerX 10.1.1.361.8519. doi:10.1007/0-387-29362-0_23. ISBN 9780387251462.
  96. ↑ Steve., Russell (2008). Microarray Technology in Practice. Meadows, Lisa A. Burlington: Elsevier. ISBN 9780080919768. OCLC 437246554.
  97. 1 2 Haas BJ, Papanicolaou A, Yassour M, Grabherr M, Blood PD, Bowden J, Couger MB, Eccles D, Li B, Lieber M, MacManes MD, Ott M, Orvis J, Pochet N, Strozzi F, Weeks N, Westerman R, William T, Dewey CN, Henschel R, LeDuc RD, Friedman N, Regev A (august 2013). "De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis". Nature Protocols. 8 (8): 1494–512. doi:10.1038/nprot.2013.084. PMC 3875132. PMID 23845962.
  98. 1 2 Pertea M, Pertea GM, Antonescu CM, Chang TC, Mendell JT, Salzberg SL (mart 2015). "StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads". Nature Biotechnology (jezik: engleski). 33 (3): 290–5. doi:10.1038/nbt.3122. PMC 4643835. PMID 25690850.
  99. ↑ Kodama Y, Shumway M, Leinonen R (januar 2012). "The Sequence Read Archive: explosive growth of sequencing data". Nucleic Acids Research. 40 (Database issue): D54–6. doi:10.1093/nar/gkr854. PMC 3245110. PMID 22009675.
  100. ↑ Greška kod citiranja: Nevaljana oznaka <ref>; nije naveden tekst za reference s imenom "#11752295"
  101. ↑ Petrov A, Shams S (1. 11. 2004). "Microarray Image Processing and Quality Control". Journal of VLSI Signal Processing Systems for Signal, Image and Video Technology. 38 (3): 211–226. Bibcode:2004JSPSy..38..211P. doi:10.1023/B:VLSI.0000042488.08307.ad. S2CID 31598448.
  102. ↑ Petrov A, Shams S (2004). "Microarray Image Processing and Quality Control". The Journal of VLSI Signal Processing-Systems for Signal, Image, and Video Technology. 38 (3): 211–226. Bibcode:2004JSPSy..38..211P. doi:10.1023/B:VLSI.0000042488.08307.ad. S2CID 31598448.
  103. ↑ Kwon YM, Ricke S (2011). High-Throughput Next Generation Sequencing. Methods in Molecular Biology. 733. SpringerLink. doi:10.1007/978-1-61779-089-8. ISBN 978-1-61779-088-1. S2CID 3684245.
  104. ↑ Nakamura K, Oshima T, Morimoto T, Ikeda S, Yoshikawa H, Shiwa Y, Ishikawa S, Linak MC, Hirai A, Takahashi H, Altaf-Ul-Amin M, Ogasawara N, Kanaya S (juli 2011). "Sequence-specific error profile of Illumina sequencers". Nucleic Acids Research. 39 (13): e90. doi:10.1093/nar/gkr344. PMC 3141275. PMID 21576222.
  105. ↑ Van Verk MC, Hickman R, Pieterse CM, Van Wees SC (april 2013). "RNA-Seq: revelation of the messengers". Trends in Plant Science. 18 (4): 175–9. Bibcode:2013TPS....18..175V. doi:10.1016/j.tplants.2013.02.001. hdl:1874/309456. PMID 23481128. S2CID 205453732.
  106. ↑ Andrews S (2010). "FastQC: A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data". Babraham Bioinformatics. Pristupljeno 23. 5. 2017.
  107. ↑ Lo CC, Chain PS (novembar 2014). "Rapid evaluation and quality control of next generation sequencing data with FaQCs". BMC Bioinformatics. 15 (1). doi:10.1186/s12859-014-0366-2. PMC 4246454. PMID 25408143. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  108. 1 2 3 Trapnell C, Hendrickson DG, Sauvageau M, Goff L, Rinn JL, Pachter L (januar 2013). "Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seq". Nature Biotechnology. 31 (1): 46–53. doi:10.1038/nbt.2450. PMC 3869392. PMID 23222703.
  109. 1 2 Xie Y, Wu G, Tang J, Luo R, Patterson J, Liu S, Huang W, He G, Gu S, Li S, Zhou X, Lam TW, Li Y, Xu X, Wong GK, Wang J (juni 2014). "SOAPdenovo-Trans: de novo transcriptome assembly with short RNA-Seq reads". Bioinformatics. 30 (12): 1660–6. arXiv:1305.6760. doi:10.1093/bioinformatics/btu077. PMID 24532719. S2CID 5152689.
  110. ↑ Siadjeu, Christian; Mayland-Quellhorst, Eike; Pande, Shruti; Laubinger, Sascha; Albach, Dirk C. (2021). "Transcriptome Sequence Reveals Candidate Genes Involving in the Post-Harvest Hardening of Trifoliate Yam Dioscorea dumetorum". Plants (jezik: engleski). 10 (4): 787. Bibcode:2021Plnts..10..787S. doi:10.3390/plants10040787. PMC 8074181. PMID 33923758 Provjerite vrijednost parametra |pmid= (pomoć).
  111. ↑ HTS Mappers. http://www.ebi.ac.uk/~nf/hts_mappers/
  112. ↑ Fonseca NA, Rung J, Brazma A, Marioni JC (decembar 2012). "Tools for mapping high-throughput sequencing data". Bioinformatics. 28 (24): 3169–77. doi:10.1093/bioinformatics/bts605. PMID 23060614.
  113. ↑ Trapnell C, Pachter L, Salzberg SL (maj 2009). "TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq". Bioinformatics. 25 (9): 1105–11. doi:10.1093/bioinformatics/btp120. PMC 2672628. PMID 19289445.
  114. 1 2 Trapnell C, Williams BA, Pertea G, Mortazavi A, Kwan G, van Baren MJ, Salzberg SL, Wold BJ, Pachter L (maj 2010). "Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation". Nature Biotechnology. 28 (5): 511–5. doi:10.1038/nbt.1621. PMC 3146043. PMID 20436464.
  115. ↑ Miller JR, Koren S, Sutton G (juni 2010). "Assembly algorithms for next-generation sequencing data". Genomics. 95 (6): 315–27. doi:10.1016/j.ygeno.2010.03.001. PMC 2874646. PMID 20211242.
  116. ↑ O'Neil ST, Emrich SJ (juli 2013). "Assessing De Novo transcriptome assembly metrics for consistency and utility". BMC Genomics. 14: 465. doi:10.1186/1471-2164-14-465. PMC 3733778. PMID 23837739.
  117. ↑ Smith-Unna R, Boursnell C, Patro R, Hibberd JM, Kelly S (august 2016). "TransRate: reference-free quality assessment of de novo transcriptome assemblies". Genome Research. 26 (8): 1134–44. doi:10.1101/gr.196469.115. PMC 4971766. PMID 27252236.
  118. ↑ Li B, Fillmore N, Bai Y, Collins M, Thomson JA, Stewart R, Dewey CN (decembar 2014). "Evaluation of de novo transcriptome assemblies from RNA-Seq data". Genome Biology. 15 (12). doi:10.1186/s13059-014-0553-5. PMC 4298084. PMID 25608678. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  119. ↑ Zerbino DR, Birney E (maj 2008). "Velvet: algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs". Genome Research. 18 (5): 821–9. doi:10.1101/gr.074492.107. PMC 2336801. PMID 18349386.
  120. ↑ Schulz MH, Zerbino DR, Vingron M, Birney E (april 2012). "Oases: robust de novo RNA-seq assembly across the dynamic range of expression levels". Bioinformatics. 28 (8): 1086–92. doi:10.1093/bioinformatics/bts094. PMC 3324515. PMID 22368243.
  121. ↑ Robertson G, Schein J, Chiu R, Corbett R, Field M, Jackman SD, et al. (novembar 2010). "De novo assembly and analysis of RNA-seq data". Nature Methods. 7 (11): 909–12. doi:10.1038/nmeth.1517. hdl:1885/51040. PMID 20935650. S2CID 1034682.
  122. 1 2 Grabherr MG, Haas BJ, Yassour M, Levin JZ, Thompson DA, Amit I, Adiconis X, Fan L, Raychowdhury R, Zeng Q, Chen Z, Mauceli E, Hacohen N, Gnirke A, Rhind N, di Palma F, Birren BW, Nusbaum C, Lindblad-Toh K, Friedman N, Regev A (maj 2011). "Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome". Nature Biotechnology. 29 (7): 644–52. doi:10.1038/nbt.1883. PMC 3571712. PMID 21572440.
  123. ↑ Chevreux B, Pfisterer T, Drescher B, Driesel AJ, Müller WE, Wetter T, Suhai S (juni 2004). "Using the miraEST assembler for reliable and automated mRNA transcript assembly and SNP detection in sequenced ESTs". Genome Research. 14 (6): 1147–59. doi:10.1101/gr.1917404. PMC 419793. PMID 15140833.
  124. ↑ Margulies M, Egholm M, Altman WE, Attiya S, Bader JS, Bemben LA, et al. (septembar 2005). "Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors". Nature. 437 (7057): 376–80. Bibcode:2005Natur.437..376M. doi:10.1038/nature03959. PMC 1464427. PMID 16056220.
  125. ↑ Kumar S, Blaxter ML (oktobar 2010). "Comparing de novo assemblers for 454 transcriptome data". BMC Genomics. 11. doi:10.1186/1471-2164-11-571. PMC 3091720. PMID 20950480. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  126. ↑ Bankevich A, Nurk S, Antipov D, Gurevich AA, Dvorkin M, Kulikov AS, Lesin VM, Nikolenko SI, Pham S, Prjibelski AD, Pyshkin AV, Sirotkin AV, Vyahhi N, Tesler G, Alekseyev MA, Pevzner PA (maj 2012). "SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing". Journal of Computational Biology. 19 (5): 455–77. doi:10.1089/cmb.2012.0021. PMC 3342519. PMID 22506599.
  127. ↑ Li B, Dewey CN (august 2011). "RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome". BMC Bioinformatics. 12. doi:10.1186/1471-2105-12-323. PMC 3163565. PMID 21816040. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  128. ↑ Kovaka, Sam; Zimin, Aleksey V.; Pertea, Geo M.; Razaghi, Roham; Salzberg, Steven L.; Pertea, Mihaela (8. 7. 2019). "Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2". bioRxiv: 694554. doi:10.1101/694554. Pristupljeno 27. 8. 2019.
  129. ↑ Gehlenborg N, O'Donoghue SI, Baliga NS, Goesmann A, Hibbs MA, Kitano H, Kohlbacher O, Neuweger H, Schneider R, Tenenbaum D, Gavin AC (mart 2010). "Visualization of omics data for systems biology". Nature Methods (jezik: engleski). 7 (3 Suppl): S56–68. doi:10.1038/nmeth.1436. PMID 20195258. S2CID 205419270.
  130. ↑ Anders S, Pyl PT, Huber W (januar 2015). "HTSeq—a Python framework to work with high-throughput sequencing data". Bioinformatics. 31 (2): 166–9. doi:10.1093/bioinformatics/btu638. PMC 4287950. PMID 25260700.
  131. ↑ Bray NL, Pimentel H, Melsted P, Pachter L (maj 2016). "Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification". Nature Biotechnology. 34 (5): 525–7. doi:10.1038/nbt.3519. PMID 27043002. S2CID 205282743.
  132. ↑ Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N, Marth G, Abecasis G, Durbin R (august 2009). "The Sequence Alignment/Map format and SAMtools". Bioinformatics. 25 (16): 2078–9. doi:10.1093/bioinformatics/btp352. PMC 2723002. PMID 19505943.
  133. ↑ Love MI, Huber W, Anders S (2014). "Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2". Genome Biology. 15 (12). doi:10.1186/s13059-014-0550-8. PMC 4302049. PMID 25516281. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  134. ↑ Frazee AC, Pertea G, Jaffe AE, Langmead B, Salzberg SL, Leek JT (mart 2015). "Ballgown bridges the gap between transcriptome assembly and expression analysis". Nature Biotechnology (jezik: engleski). 33 (3): 243–6. doi:10.1038/nbt.3172. PMC 4792117. PMID 25748911.
  135. ↑ Fang Z, Cui X (maj 2011). "Design and validation issues in RNA-seq experiments". Briefings in Bioinformatics. 12 (3): 280–7. doi:10.1093/bib/bbr004. PMID 21498551.
  136. ↑ Ramsköld D, Wang ET, Burge CB, Sandberg R (decembar 2009). "An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data". PLOS Computational Biology. 5 (12): e1000598. Bibcode:2009PLSCB...5E0598R. doi:10.1371/journal.pcbi.1000598. PMC 2781110. PMID 20011106.
  137. ↑ Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F (juni 2002). "Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes". Genome Biology. 3 (7): RESEARCH0034. doi:10.1186/gb-2002-3-7-research0034. PMC 126239. PMID 12184808. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  138. ↑ Core LJ, Waterfall JJ, Lis JT (decembar 2008). "Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters". Science. 322 (5909): 1845–8. Bibcode:2008Sci...322.1845C. doi:10.1126/science.1162228. PMC 2833333. PMID 19056941.
  139. ↑ Camarena L, Bruno V, Euskirchen G, Poggio S, Snyder M (april 2010). "Molecular mechanisms of ethanol-induced pathogenesis revealed by RNA-sequencing". PLOS Pathogens. 6 (4): e1000834. doi:10.1371/journal.ppat.1000834. PMC 2848557. PMID 20368969.
  140. 1 2 Govind G, Harshavardhan VT, ThammeGowda HV, Patricia JK, Kalaiarasi PJ, Dhanalakshmi R, Iyer DR, Senthil Kumar M, Muthappa SK, Sreenivasulu N, Nese S, Udayakumar M, Makarla UK (juni 2009). "Identification and functional validation of a unique set of drought induced genes preferentially expressed in response to gradual water stress in peanut". Molecular Genetics and Genomics. 281 (6): 591–605. doi:10.1007/s00438-009-0432-z. PMC 2757612. PMID 19224247.
  141. ↑ Tavassoly, Iman; Goldfarb, Joseph; Iyengar, Ravi (4. 10. 2018). "Systems biology primer: the basic methods and approaches". Essays in Biochemistry (jezik: engleski). 62 (4): 487–500. doi:10.1042/EBC20180003. ISSN 0071-1365. PMID 30287586. S2CID 52922135.
  142. ↑ Costa V, Aprile M, Esposito R, Ciccodicola A (februar 2013). "RNA-Seq and human complex diseases: recent accomplishments and future perspectives". European Journal of Human Genetics. 21 (2): 134–42. doi:10.1038/ejhg.2012.129. PMC 3548270. PMID 22739340.
  143. ↑ Khurana E, Fu Y, Chakravarty D, Demichelis F, Rubin MA, Gerstein M (februar 2016). "Role of non-coding sequence variants in cancer". Nature Reviews Genetics. 17 (2): 93–108. doi:10.1038/nrg.2015.17. PMID 26781813. S2CID 14433306.
  144. ↑ Slotkin RK, Martienssen R (april 2007). "Transposable elements and the epigenetic regulation of the genome". Nature Reviews Genetics. 8 (4): 272–85. doi:10.1038/nrg2072. PMID 17363976. S2CID 9719784.
  145. ↑ Proserpio V, Mahata B (februar 2016). "Single-cell technologies to study the immune system". Immunology. 147 (2): 133–40. doi:10.1111/imm.12553. PMC 4717243. PMID 26551575.
  146. ↑ Byron SA, Van Keuren-Jensen KR, Engelthaler DM, Carpten JD, Craig DW (maj 2016). "Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges". Nature Reviews Genetics. 17 (5): 257–71. doi:10.1038/nrg.2016.10. PMC 7097555. PMID 26996076.
  147. ↑ Wu HJ, Wang AH, Jennings MP (februar 2008). "Discovery of virulence factors of pathogenic bacteria" (PDF). Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1): 93–101. doi:10.1016/j.cbpa.2008.01.023. PMID 18284925.
  148. ↑ Suzuki S, Horinouchi T, Furusawa C (decembar 2014). "Prediction of antibiotic resistance by gene expression profiles". Nature Communications. 5. Bibcode:2014NatCo...5.5792S. doi:10.1038/ncomms6792. PMC 4351646. PMID 25517437. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  149. ↑ Westermann AJ, Gorski SA, Vogel J (septembar 2012). "Dual RNA-seq of pathogen and host" (PDF). Nature Reviews. Microbiology. 10 (9): 618–30. doi:10.1038/nrmicro2852. PMID 22890146. S2CID 205498287.
  150. ↑ Durmuş S, Çakır T, Özgür A, Guthke R (2015). "A review on computational systems biology of pathogen-host interactions". Frontiers in Microbiology. 6: 235. doi:10.3389/fmicb.2015.00235. PMC 4391036. PMID 25914674.
  151. 1 2 Garg R, Shankar R, Thakkar B, Kudapa H, Krishnamurthy L, Mantri N, Varshney RK, Bhatia S, Jain M (januar 2016). "Transcriptome analyses reveal genotype- and developmental stage-specific molecular responses to drought and salinity stresses in chickpea". Scientific Reports. 6. Bibcode:2016NatSR...619228G. doi:10.1038/srep19228. PMC 4725360. PMID 26759178. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  152. ↑ García-Sánchez S, Aubert S, Iraqui I, Janbon G, Ghigo JM, d'Enfert C (april 2004). "Candida albicans biofilms: a developmental state associated with specific and stable gene expression patterns". Eukaryotic Cell. 3 (2): 536–45. doi:10.1128/EC.3.2.536-545.2004. PMC 387656. PMID 15075282.
  153. ↑ Rich SM, Leendertz FH, Xu G, LeBreton M, Djoko CF, Aminake MN, Takang EE, Diffo JL, Pike BL, Rosenthal BM, Formenty P, Boesch C, Ayala FJ, Wolfe ND (septembar 2009). "The origin of malignant malaria". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35): 14902–7. Bibcode:2009PNAS..10614902R. doi:10.1073/pnas.0907740106. PMC 2720412. PMID 19666593.
  154. ↑ Mok S, Ashley EA, Ferreira PE, Zhu L, Lin Z, Yeo T, et al. (januar 2015). "Drug resistance. Population transcriptomics of human malaria parasites reveals the mechanism of artemisinin resistance". Science. 347 (6220): 431–5. Bibcode:2015Sci...347..431M. doi:10.1126/science.1260403. PMC 5642863. PMID 25502316.
  155. 1 2 3 4 Page, Tessa M.; Lawley, Jonathan W. (2022). "The Next Generation Is Here: A Review of Transcriptomic Approaches in Marine Ecology". Frontiers in Marine Science. 9. Bibcode:2022FrMaS...957921P. doi:10.3389/fmars.2022.757921. hdl:10072/428702. ISSN 2296-7745.
  156. ↑ Verbruggen N, Hermans C, Schat H (mart 2009). "Molecular mechanisms of metal hyperaccumulation in plants" (PDF). The New Phytologist. 181 (4): 759–76. Bibcode:2009NewPh.181..759V. doi:10.1111/j.1469-8137.2008.02748.x. PMID 19192189.
  157. ↑ Li Z, Zhang Z, Yan P, Huang S, Fei Z, Lin K (novembar 2011). "RNA-Seq improves annotation of protein-coding genes in the cucumber genome". BMC Genomics. 12. doi:10.1186/1471-2164-12-540. PMC 3219749. PMID 22047402. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  158. ↑ Hobbs M, Pavasovic A, King AG, Prentis PJ, Eldridge MD, Chen Z, Colgan DJ, Polkinghorne A, Wilkins MR, Flanagan C, Gillett A, Hanger J, Johnson RN, Timms P (septembar 2014). "A transcriptome resource for the koala (Phascolarctos cinereus): insights into koala retrovirus transcription and sequence diversity". BMC Genomics. 15 (1). doi:10.1186/1471-2164-15-786. PMC 4247155. PMID 25214207. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  159. ↑ Howe GT, Yu J, Knaus B, Cronn R, Kolpak S, Dolan P, Lorenz WW, Dean JF (februar 2013). "A SNP resource for Douglas-fir: de novo transcriptome assembly and SNP detection and validation". BMC Genomics. 14: 137. doi:10.1186/1471-2164-14-137. PMC 3673906. PMID 23445355.
  160. ↑ McGrath LL, Vollmer SV, Kaluziak ST, Ayers J (januar 2016). "De novo transcriptome assembly for the lobster Homarus americanus and characterization of differential gene expression across nervous system tissues". BMC Genomics. 17. doi:10.1186/s12864-016-2373-3. PMC 4715275. PMID 26772543. Nepoznati parametar |article-number= zanemaren (pomoć)
  161. ↑ Noller HF (1991). "Ribosomal RNA and translation". Annual Review of Biochemistry. 60: 191–227. doi:10.1146/annurev.bi.60.070191.001203. PMID 1883196.
  162. ↑ Christov CP, Gardiner TJ, Szüts D, Krude T (septembar 2006). "Functional requirement of noncoding Y RNAs for human chromosomal DNA replication". Molecular and Cellular Biology. 26 (18): 6993–7004. doi:10.1128/MCB.01060-06. PMC 1592862. PMID 16943439.
  163. ↑ Kishore S, Stamm S (januar 2006). "The snoRNA HBII-52 regulates alternative splicing of the serotonin receptor 2C". Science. 311 (5758): 230–2. Bibcode:2006Sci...311..230K. doi:10.1126/science.1118265. PMID 16357227. S2CID 44527461.
  164. ↑ Hüttenhofer A, Schattner P, Polacek N. "Non-coding RNAs: hope or hype?". Trends in Genetics. 21.
  165. ↑ Esteller M (novembar 2011). "Non-coding RNAs in human disease". Nature Reviews Genetics. 12 (12): 861–74. doi:10.1038/nrg3074. PMID 22094949. S2CID 13036469.
  166. ↑ "Gene Expression Omnibus". www.ncbi.nlm.nih.gov. Pristupljeno 26. 3. 2018.

Bilješke

[uredi | uredi izvor]
  1. ↑ U molekularnoj biologiji, hibridizacija je fenomen u kojem se jednolančane molekule dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) ili ribonukleinske kiseline (RNK) spajaju u komplementarnu DNK ili RNK dinamike.
  2. ↑ Jedan pikolitar je oko 30 miliona puta manji od kapi vode.

Dopunska literatura

[uredi | uredi izvor]
Preuzeto iz "https://bs.wikipedia.org/w/index.php?title=Transkriptomske_tehnologije&oldid=3928487"