ELISA test

S Wikipedije, slobodne enciklopedije
Idi na navigaciju Idi na pretragu
Elizna analiza razvijena sa 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidinom

Enzimski povezani imunosorbentni test (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay – ELISA) je uobičajeni analitički biohemijski test, koji su prvi opisali Engvall i Perlmann, 1971.[1] Analiza koristi čvrstu fazu tipa enzimskog testa (EIA) za otkrivanje prisustva liganda (obično proteina) u tečnom uzorku, koristeći antitijela usmjerena na protein koji se mjeri. Eliza se koristi kao dijagnostički alat u medicini, biljnoj patologiji i biotehnologiji, kao i kontroli kvaliteta u različitim industrijama.

U najjednostavnijem obliku elizee, antigeni iz uzorka koji se testira pričvršćeni su na površinu. Zatim se na površinu nanosi odgovarajuće antitijelo, kako bi moglo vezati antigen. Ovo antitijelo veže se za enzim, a zatim se uklanjaju sva nevezana antitijela. U završnom koraku dodaje se supstanca koja sadrži enzim supstrat. Ako je došlo do vezanja, naknadna reakcija proizvodi prepoznatljiv signal, najčešće promjenom boje.

Izvođenje testa uključuje najmanje jedno antitelo, specifično za određeni antigen. Uzorak sa nepoznatom količinom antigena imobilizira se na čvrstom nosaču (obično polistirenska mikrotitarska ploča) ili nespecifično (putem adsorpcije na površinu) ili posebno (hvatanjem pomoću drugog antitela specifičnog za isti antigen, u tzv. "sendvič"-elizi). Nakon imobilizacije antigena, dodaju se detektirajuća antitijela, formirajući kompleks sa antigenom. Detekcijsko antitijelo može se kovalentno povezati sa enzimom ili ga samo može detektirati sekundarno antitijelo, koje je povezano sa enzimom putem biokonjugacije. Između svakog koraka, pločica se obično opere blagim deterdžentnim rastvorom kako bi se uklonili svi proteini ili antitijela koja nisu specifično vezana. Nakon završnog pranja, ploča se razvija dodavanjem enzimskog supstrata, da bi se dobio vidljivi signal, koji ukazuje na količinu antigena u uzorku.

Treba napomenuti da eliza-test može uklhučiti i druge oblike testova vezanja liganda, umjesto strogo "imunskih" testova, iako je naziv nosio originaln prefiks "imuno", zbog uobičajene upotrebe i historije razvoja ovog metoda. Tehnika u osnovi zahtijeva bilo koji reagirajući reagens koji se može imobilizirati na čvrstoj fazi zajedno s reagensom za detekciju, koji će se specifično vezati i koristiti enzim za generiranje signala kojeg se može pravilno kvantificirati. Između ispiranja, samo ligand i njegovi specifični vezivni dijelovi ostaju specifično vezani ili "imunosorbantni", pomoću interakcije antigen-antitijelo na čvrstu fazu, dok se nespecifične ili nevezane komponente ispiraju. Za razliku od ostalih spektrofotometrijskih formata za mokro laboratorijsko ispitivanje, u kojima se ista reakcijska posuda (npr. liveta) može ponovo upotrijebiti nakon pranja, ploče za elizu imaju reakcijske produkte imunosorbirane na čvrstoj fazi, koja je dio ploče, pa ih nije lahko ponovno iskoristiti.

Princip[uredi | uredi izvor]

Kao analitički biohemijski test i tehnika "mokre laboratorije", eliza uključuje otkrivanje analita (tj. specifične supstance, čija se prisutnost kvantitativno ili kvalitativno analizira) u uzorku tečnosti metodom koji i dalje koristi tečni reagens tokom analize (tj. kontroliranog slijeda biohemijskih reakcija koji će generirati signal za lahko kvantificiranje i tumačenje, kao mjere količine analita u uzorku) koji ostaje tečan i unutar reakcijske komore ili prijeko potreban za zadržavanje reaktanata.[2][3] To je za razliku od tehnika "suhe laboratorije" koja koristi suhe trake. Čak i ako je uzorak tečan (npr. Izmjereni mali pad), završni korak otkrivanja u "suhoj" analizi uključuje očitavanje osušene trake metodima kao što je reflektometrija i nije potrebna komora za zadržavanje reakcije, kako bi se spriječilo prelijevanje ili miješanje između uzoraka .[4]

Kao heterogeni test, eliza odvaja neke komponente analitičke reakcijske smjese adsorbujući određene komponente na čvrstu fazu, koja je fizički imobilizirana. U ovom testu, tečni uzorak dodaje se u stacionarnu čvrstu fazu sa posebnim svojstvima vezanja, nakon čega slijedi više tekućih reagensa koji se sekvencijalno dodaju, inkubiraju i ispiru. Makon toga slijedi neka optička promjena (npr. razvoj boje proizvodom enzimskih reakcija) u konačnoj tečnosti u jažici iz koje se mjeri količina analita. Kvantitativno "očitavanje" obično se zasniva na detekciji intenziteta propuštene svjetlosti, pomoću spektrofotometrije, što uključuje kvantitativno prenošenje neke određene talasne dužine svjetlosti kroz tečnost (kao i prozirno dno komorice u višestruko-formatiranoj ploči posudica).[2] [3] Osetljivost detekcije zavisi od pojačanja signala tokom analitskih reakcija. Budući da su enzimske reakcije vrlo poznati procesi pojačavanja, signal generiraju enzimi koji su povezani sa reagensima za detekciju u fiksnim omjerima, kako bi se omogućila precizna kvantifikacija, a samim tim jw i naziv "enzimski vezana".[5]

Analit se naziva i ligand, jer će se specifično vezati ili povezati sa reagensom za detekciju, pa eliza spada u veću kategoriju testova vezanja liganada.[2] Reagens za vezanje specifičan za ligand je "imobiliziran", tj. obično je premazan i osušen na prozirnom dnu, a ponekad i na bočnom zidu mjesta za uzorak[6] (stacionarna "čvrsta faza" / "čvrsta podloga" ovdje, za razliku od čvrstih mikročestica / kuglica koje se mogu isprati), koja je obično izrađena kao ploča s više jažica poznata kao "eliza ploča". Konvencijskio, kao i drugi oblici imunoeseja, koristi se specifičnost reakcije tipa antigenantitijelo, jer je lahko podići antitijelo specifično protiv antigena u rinfuzi kao reagensa. Alternativno, ako je analit sam antitijelo, njegov ciljni antigen može se koristiti kao vezivni reagens.[7]

Tipovi[uredi | uredi izvor]

Postoje mnogi eliza-testovi za određene molekule, koji koriste odgovarajuća antitijela. Podeljeni su u nekoliko tipova, zasnovanih na načinu vezanja i upotrebe analita i antitijela.[8][9]

Direktna eliza
DirecDijagram direktnog teasta[10]
Sendvoč-eliza
Sendvič eliza.
(1) Ploča presvučena antitijelima za hvatanje;
(2) dodavanje suzorka i bilo koji prisutni antigen veže se za vezanje antitijela;
(3) dodaje se antitijelo za otkrivanje i veže se za antigen;
(4) dodaje se enzimski vezano sekundarno antitijelo i veže se za otkrivena antitela;
(5) dodaje se supstrat koji se enzimom pretvara u oblik koji se može detektirati.[11]
Kompetitivna eliza
Reverzna eliza[12][13]

Uobičajeni enzimski markeri[uredi | uredi izvor]

Sljedeća tabela navodi enzimske markere koji se obično koriste u eliza-testovima, koji omogućavaju mjerenje rezultata ispitivanja po završetku.

  • OPD (o-fenilendiamin dihidroklorid) pretvara jantar za otkrivanje HRP-a (hrenove peroksidaze), koji se često koristi kao konjugirani protein.[14]
  • TMB (3,3',5,5'- tetrametilbenzidin) postaje plav kada otkriva HRP i žut nakon dodavanja sumporne ili fosforne kiseline.
  • ABTS (2,2'-azinobis [3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina] - diamonijeva so) postaje zelena kada otkriva HRP.
  • PNPP (p- nitrofenil-fosfat, dinatrijeva so) postaje žuta pri otkrivanju alkalne fosfataze.

Primjena[uredi | uredi izvor]

Ljudski anti-IgG, dvostruko antitijelo sendvič-elize

Budući da se eliza može provesti za procjenu prisustva antigena ili prisustva antitijela u uzorku, to je koristan alat za određivanje koncentracije serumskih antitijela (kao što je HIV- test ili testa za virus zapadnog Nila). Također je pronašao primjenu i u prehrambenoj industriji, u otkrivanju potencijalnih alergena u hrani, kao što su mlijeko, kikiriki, orah, badem i jaja[15] te kao serološki test krvi za celijakiju.[16][17] Također se može koristiti u toksikologiji kao brzi pretpostavljeni pregled za određene klase lijekova.

Ploča za analizu imunosorbenta povezanog enzimom

Eliza je prvi skrining test koji se široko koristi za dijagnostiku HIV-a zbog svoje visoke osjetljivosti. Osobni razblaži se 400 puta i nanese na ploču na koju su vezani HIV antigeni. Ako su antitijela na HIV prisutna u serumu, mogu se vezati za ove HIV antigene. Zatim se ploča opere kako bi se uklonile sve ostale komponente seruma. Na ploču se zatim nanosi posebno pripremljeno "sekundarno antitijelo" – antitelo koje se veže za druga antitijela, nakon čega slijedi još jedno ispiranje. Ovo sekundarno antitijelo je pretnodno hemijski vezano za enzim.

Dakle, pločica će sadržavati enzim proporcionalno količini sekundarnog antitijela vezanog za ploču. Primjenjuje se supstrat za enzim, a kataliza enzima dovodi do promjene boje ili fluorescencije. Rezultati testa prikazani su kao broj; najkontroverzniji aspekt ovog testa je određivanje "granične tačke" između pozitivnog i negativnog rezultata.

Tačka prekida može se odrediti upoređivanjem sa poznatim standardom. Ako se ovaj test koristi za provjeru lijekova na radnom mjestu, uspostavlja se granična koncentracija, naprimjer, 50 ng /ml, a pripremit će se uzorak koji sadrži standardnu koncentraciju analita. Nepoznate koje generiraju jači signal od poznatog uzorka su "pozitivne". One koji generiraju slabiji signal su "negativne".

Dr Dennis E Bidwell i Alister Voller kreirali su eliza test za otkrivanje različitih tipova bolesti, kao što su denga, malarija, Chagasova bolest, Johneova bolest i druge.[18] Eliza testovi se također koriste u in vitro dijagnostici u medicinskim laboratorijama. Ostale oblasti upotrebe uključuju:

Shematski dijagram toka: Eliza i COVID-19

Također pogledajte[uredi | uredi izvor]

Reference[uredi | uredi izvor]

  1. ^ Engvall, E (1972-11-22). "Enzyme-linked immunosorbent assay, Elisa". The Journal of Immunology. 109 (1): 129–135. ISSN 0022-1767. PMID 4113792.
  2. ^ a b c Msagati, T.A. (2017). Food Forensics and Toxicology. John Wiley & Sons. str. PT229. ISBN 9781119101383.
  3. ^ a b Crowther, J.R. (1995). "Chapter 2: Basic Principles of ELISA". ELISA: Theory and Practice. Methods in Molecular Biology. 42. Humana Press. str. 35–62. doi:10.1385/0-89603-279-5:1. ISBN 0896032795. PMID 7655571.
  4. ^ Sonntag, O. (1993). "Chapter 1: Introduction to dry chemistry". u van der Vliet, P.C. (ured.). Dry Chemistry: Analysis with carrier-bound reagents. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 25. str. 1–6. ISBN 9780080887364.
  5. ^ Hsieh, Y.-H.P.; Rao, Q. (2017). Nielsen, S.S. (ured.). Food Analysis. Springer. str. 491–98. ISBN 9783319457765.
  6. ^ Schasfoort, R.B.M. (2017). Handbook of Surface Plasmon Resonance (2nd izd.). Royal Society of Chemistry. str. 296. ISBN 9781782627302.
  7. ^ Elgert, K.D. (2009). Immunology: Understanding the Immune System. John Wiley & Sons. str. 149–50. ISBN 9780470081570.
  8. ^ R., Crowther, J. (1995). ELISA : theory and practice. Methods in Molecular Biology. 42. Totowa, N.J.: Humana Press. str. 1–218. doi:10.1385/0-89603-279-5:1. ISBN 978-0896032798. OCLC 32130600. PMID 7655571.
  9. ^ ROBERT., HNASKO (2016). ELISA (SOFTCOVER reprint OF izd.). [Place of publication not identified]: HUMANA. ISBN 978-1493953851. OCLC 960834982.
  10. ^ Spence, Zachary (2018-10-18). "Biochemistry 8th ed - Jeremy M. Berg" (jezik: engleski): 83. Cite journal zahtijeva |journal= (pomoć)
  11. ^ Schmidt, SD; Mazzella, MJ; Nixon, RA; Mathews, PM (2012). Aβ measurement by enzyme-linked immunosorbent assay. Methods in Molecular Biology. 849. str. 507–27. doi:10.1007/978-1-61779-551-0_34. ISBN 978-1-61779-550-3. PMID 22528112.
  12. ^ 7767404, Charbonnet, Derrick, "United States Patent: 7767404 - Apparatus and method for single-step immunosorbent assay for single and multiple analytes", izdan August 3, 2010 
  13. ^ 8735142, Charbonnet, Derrick & Norman Scott Evans, "United States Patent: 8735142 - Systems and methods for immunosorbent assays for single and multiple analytes", izdan May 27, 2014 
  14. ^ "Enzyme Substrates for ELISA" (jezik: engleski). Thermo Fisher Scientific - US. Pristupljeno 2018-06-06.
  15. ^ "Food Allergen Partnership" (Press release). FDA. January 2001. Pristupljeno August 20, 2015.
  16. ^ Sblattero, D.; Berti, I.; Trevisiol, C.; Marzari, R.; Tommasini, A.; Bradbury, A.; Fasano, A.; Ventura, A.; Not, T. (2000). "Human recombinant tissue transglutaminase ELISA: an innovative diagnostic assay for celiac disease". The American Journal of Gastroenterology. 95 (5): 1253–7. PMID 10811336.
  17. ^ Porcelli, Brunetta; Ferretti, Fabio; Vindigni, Carla; Terzuoli, Lucia (2014). "Assessment of a Test for the Screening and Diagnosis of Celiac Disease". Journal of Clinical Laboratory Analysis. 30 (1): 65–70. doi:10.1002/jcla.21816. PMC 6807240. PMID 25385391.
  18. ^ Griffin, J. F. T.; Spittle, E.; Rodgers, C. R.; Liggett, S.; Cooper, M.; Bakker, D.; Bannantine, J. P. (2005). "Immunoglobulin G1 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Diagnosis of Johne's Disease in Red Deer (Cervus elaphus)". Clinical and Vaccine Immunology. 12 (12): 1401–9. doi:10.1128/CDLI.12.12.1401-1409.2005. PMC 1317074. PMID 16339063.
  19. ^ Dhamad, AE; Abdal Rhida, MA (2020). "COVID-19: molecular and serological detection methods". PeerJ. 8: e10180. doi:10.7717/peerj.10180. PMC 7547594. PMID 33083156 Provjerite vrijednost parametra |pmid= (pomoć).

Vanjski linkovi[uredi | uredi izvor]

Šablon:Imunološke tehnike i testovi