Idi na sadržaj

Mala interferirajuća RNK

S Wikipedije, slobodne enciklopedije
Posredovanje interferencije RNK u kultiviranim ćelijama sisara.

Mala interferirajuća RNK (siRNK), ponekad poznata kao kratka interferirajuća RNK ili utišavajuća RNK, je klasa dvolančanih RNK na početku molekula, nekodirajuče RNK tipske dužine 20-24 (obično 21) bazni par, slično miRNK, i djeluje unutar puta interferencije RNK (RNAi). Ometa ekspresiju specifičnih gena sa komplementarnim nukleotidnim sekvencama, razgradnjom iRNK nakon transkripcije, sprečavajući translaciju.[1][2]

Struktura[uredi | uredi izvor]

Prirodne siRNK imaju dobro definiranu strukturu koja je kratka (obično 20 do 24-bp) dvolančana RNK (dsRNA) sa fosforiliranim krajevima od 5' i hidroksiliranim 3' završava se sa dva dodatna nukleotida. Dicer enzim katalizuje proizvodnju siRNA iz dugih dsRNK i malih pin RNK.[3] siRNA se također mogu uvesti u ćelije transfekcijom. Budući da se u principu svaki gen može nokdaunirati sintetskom siRNK sa komplementarnom sekvencom, siRNK su važan alat za validaciju funkcije gena i ciljanja lijekova u postgenomskoj eri.

Mehanizam[uredi | uredi izvor]

Mehanizam kojim prirodna siRNK uzrokuje utišavanje gena potiskivanjem translacije odvija se na sljedeći način:

Mehanizam djelovanja siRNK
  1. Dugolančana dsRNK (koja može doći od ukosnice, komplementarnih RNK i RNK ovisnih o RNK-polimerazama) cijepa se endoribonukleazom zvanom Dicer. Dicer siječe dugolančanu dsRNK da bi formirao kratku interferirajuću RNK ili siRNA; to je ono što omogućava molekulima da formiraju RNK-inducirani kompleks utišavanja (RISC).
  2. Kada siRNK uđe u ćeliju, ugrađuje se u druge proteine kako bi formirala RISC.
  3. Jednom kada je siRNK dio kompleksa RISC, odmotava se i formira jednolančanu siRNK.
  4. Sekvenca koja je termodinamički manje stabilna zbog svog uparivanja baza na 5´kraju je odabran da ostane dio RISC-kompleksa
  5. Jednolančana siRNK koja je dio RISC kompleksa sada može skenirati i pronaći komplementarnu iRNK
  6. Jednom kada se jednolančana siRNK (dio RISC kompleksa) veže za svoju ciljnu iRNL, inducira cijepanje iRNK.
  7. iRNK je sada isječena i ćelija prepoznata kao abnormalna. Ovo uzrokuje degradaciju iRNK i zauzvrat nema translacije iRNK u aminokiseline, a zatim u proteine. Tako se utišava gen koji kodira tu iRNK.

siRNK je također slična miRNK; međutim, miRNK izvedene su iz kraćih RNK proizvoda matične petlje, tipski utišavajući gene potiskivanjem translacije i imaju širu specifičnost djelovanja, dok siRNK obično djeluju tako što cijepaju iRNK prije translacije i imaju 100% komplementarnost, što znači vrlo čvrstu ciljanu specifičnost.[4][5]

Indukcija RNAi upotrebom siRNA ili njihovih biosintetskih prekursora[uredi | uredi izvor]

Obojeni Dicer proteinski domen.

Transfekcija nokdaunom gena egzogene siRNK je često nezadovoljavajuća jer je efekt samo prolazan, posebno u ćelijama koje se brzo dijele. Ovo se može prevazići stvaranjem ekspresijskog vektora za siRNK. Sekvenca siRNK modificirana je, kako bi se uvela kratka petlja između dva lanca. Rezultirajući transkript je kratolančana RNK (shRNK), koju Dicer može obraditi u funkcionalnu siRNK na svoj uobičajeni način.[6] Tipiske transkripcijske kasete koriste promotor RNK-polimeraze III (npr. U6 ili H1) za usmjeravanje transkripcije malih jedarnih RNK (snRNK) (U6 je uključen u splajsing gena; H1 je RNazna komponenta ljudske RNKaze P). Teoretizira se da rezultirajući transkript siRNK zatim obrađuje Dicer.

Efikasnost nodauna gena se takođe može poboljšati korišćenjem stiskanja ćelija.[7]

Aktivnost siRNK u RNKi u velikoj mjeri ovisi o njegovoj sposobnosti vezivanja za RNK-inducirani kompleks utišavanja (RISC). Vezanje dupleksa siRNK za RISC praćeno je odmotavanjem i cijepanjem sens lanca pomoću endonukleaza. Preostali anti-sens lanac-RISC kompleks se tada može vezati za ciljane mRNK za iniciranje utišavanja transkripcije.[8]

Aktivacija RNK[uredi | uredi izvor]

Utvrđeno je da dsRNK također može aktivirati ekspresije gena, mehanizam koji je nazvan "mala RNK-indukovana aktivacija gena" ili RNKa. Pokazalo se da dsRNK ciljane na promotore gena induciraju moćnu transkripcijsku aktivaciju povezanih gena. RNKa je demonstrirana u ljudskim ćelijama, korištenjem sintetskih dsRNK, zvanih "male aktivirajuće RNK" (saRNK). Do sada nije poznato koliko je RNKa konzervirana u drugim organizmima.[9] Jedan izvještaj u komarcu Aedes aegypti pokazao je da postoje dokazi za RNKa i mogu se postići kratkim ili dugim dsRNK, ciljajući na promotorske regije.[10]

Posttranskripcijsko utišavanje gena[uredi | uredi izvor]

Utišavanje gena nakon transkripcije izazvano putem siRNK počinje sastavljanjem RNK-indukovanog kompleksa utišavanja (RISC). Kompleks utišava određenu ekspresiju gena, cijepanjem molekula iRNK koje kodiraju ciljne gene. Za početak procesa, jedan od dva lanca siRNK, vodeći lanac (anti-sense lanac), bit će učitan u RISC dok se drugi lanac, putnički lanac (sens lanac), degradira. Za učitavanje vodiča u RISC mogu biti odgovorni određeni Dicer enzimi.[11] Zatim, siRNK skenira i usmjerava RISC na savršeno komplementarnu sekvencu na molekulama iRNK.[12] Smatra se da cijepanje molekula iRNK katalizira Piwi domen argonautskih proteina RISC-a. Molekula iRNK se zatim precizno siječe cijepanjem fosfodiestarske veze između ciljnih nukleotida koji su upareni sa ostacima siRNK 10 i 11, računajući od 5' kraja.[13] Ovo cijepanje rezultira fragmentima iRNK koji se dalje razgrađuju ćelijskim egzonukleazama. 5' fragment je degradiran sa svog 3' kraja pomoću egzosoma, dok je 3' fragment degradiran sa svog 5' kraja od 5' -3' egzoribonukleaze 1 (XRN1).[14]

Ponekad ne dođe do cijepanja ciljne molekule iRNK. U nekim slučajevima, endonukleolitsko cijepanje fosfodiestarske kičme može biti potisnuto neusklađenošću siRNK i ciljne mRNK u blizini mjesta cijepanja. U drugim slučajevima, proteini argonautskog RISC-a nemaju aktivnost endonukleaza čak i kada su ciljna mRNK i siRNK savršeno uparene. U takvim slučajevima, ekspresija gena će biti utišana mehanizmom izazvanom putemmiRNK[12]

Pojednostavljena verzija ping-pong metoda, koja uključuje proteine Aub i Ago3 koji cijepaju 3' i 5' krajeve piRNK.

[2]

Piwi-interaktivne RNK odgovorne su za utišavanje transpozona i nisu siRNK.[15] PIWI-interragirajuće RNK (piRNK) su nedavno otkrivena klasa malih nekodirajućih RNK (ncRNK) dužine od 21–35 nukleotida. Oni imaju ulogu u regulaciji ekspresije gena, utišavanju transpozona i inhibiciji virusne infekcije. Nekada smatrane kao "tamna materija" ncRNK, piRNK pojavile su se kao važni faktori u višestrukim ćelijskim funkcijama u različitim organizmima.[16]

Utišavanje transkripcijskih gena[uredi | uredi izvor]

Alternativno, siRNK mogu se ugraditi u kompleks RNK-inducirano utišavanje transkripcije (RITS). Aktivni RITS kompleks će pokrenuti formiranje heterohromatina oko DNK koji odgovara siRNK, efektivno utišavajući gene u toj regiji DNK.

Urođena imunost[uredi | uredi izvor]

Uvođenje previše siRNK može rezultirati nespecifičnim događajima zbog aktivacije urođenih imunskih odgovora.[17] Većina dosadašnjih dokaza sugerira da je to vjerovatno zbog aktivacije dsRNK senzora PKR, iako može biti uključen i gen I koji inducira retinojsku kiselinu (RIG-I).[18] Također opisana je i indukcija citokina putem receptora 7 (TLR7) sličnog tollu. Hemijska modifikacija siRNA se koristi za smanjenje aktivacije urođenog imunskog odgovora za funkciju gena i terapijske primjene. Jedan obećavajući metod za smanjenje nespecifičnih efekata je pretvaranje siRNK u mikroRNK.[19] MikroRNA se javljaju prirodno, a korištenjem ovog endogenog puta trebalo bi biti moguće postići sličan nokdown gena pri relativno niskim koncentracijama rezultirajućih siRNA. Ovo bi trebalo da minimizira nespecifične efekte.

Adaptivni imunski odgovori[uredi | uredi izvor]

Obične RNK mogu biti slabi imunogeni, ali se lahko mogu stvoriti antitijela protiv kompleksa RNK-protein. Mnoge autoimunske bolesti imaju ove tipove antitijela. Još uvijek nema izvještaja o antitijelima protiv siRNK vezanih za proteine. Neki metodi za isporuku siRNK povezuju polietilen-glikol (PEG) s oligonukleotidom smanjujući izlučivanje i poboljšavajući poluživot u cirkulaciji. Međutim, nedavno je Regado Biosciences morao prekinuti veliko ispitivanje faze III PEGiliranog RNK aptamera protiv faktora IX, zbog teške anafilaksne reakcije na PEG dio RNK. Ova reakcija je u nekim slučajevima dovela do smrti i izaziva značajnu zabrinutost oko isporuke siRNK kada su uključeni PEGilirani oligonukleotidi.[20]

Hemijske modifikacije[uredi | uredi izvor]

siRNK su hemijski modificirane, kako bi se poboljšala njihova terapeutska svojstva, kao što su poboljšana aktivnost, povećana stabilnost seruma, manje odstupanja od cilja i smanjena imunska aktivacija. Obično je siRNK inkapsulirana u nanolipidnu česticu kako bi se spriječila degradacija u krvi. Detaljna baza podataka o svim takvim hemijskim modifikacijama je u naučnoj literaturi ručno uređena kao siRNAmod.[21] Hemijska modifikacija siRNK također može nenamjerno dovesti do gubitka specifičnosti jednog nukleotida.[22]

Unutarćelijska isporuka[uredi | uredi izvor]

Unutarćelijske isporuke siRNK i dalje predstavlja izazov. Postoje tri glavne tehnike isporuke siRNA koje se razlikuju po efikasnosti i toksičnosti.

Transfekcija[uredi | uredi izvor]

U ovoj tehnici siRNK prvo mora biti dizajnirana protiv ciljnog gena. Jednom kada je siRNK konfigurisana prema genu, ona mora biti efikasno isporučena putem transfekcijskog protokola. Dostava se obično vrši pomoću kationskih liposoma, polimernih nanočestica i konjugacije lipida.[23] Ovaj metod je povoljan jer može isporučiti siRNK u većinu tipova ćelija, ima visoku efikasnost i reproduktivnost i nudi se komercijalno. Najčešći komercijalni reagensi za transfekciju siRNK su lipofektamin i neonska transfekcija. Međutim, nije kompatibilan sa svim tipovima ćelija i ima nisku efikasnost in vivo.[24][25]

Elektroporacija[uredi | uredi izvor]

Električni impulsi se također koriste za unutarćelijsku isporuku siRNK. Ćelijska membrana je građena od fosfolipida, što je čini osjetljivom na električno polje. Kada se pokrenu brzi, ali snažni električni impulsi, molekule lipida se preorijentišu, dok prolaze kroz termalne fazne prijelaze zbog zagrijavanja. Ovo rezultira stvaranjem hidrofilnih pora i lokaliziranim poremećajima u membrani ćelijskih lipidnih dvoslojeva, što također uzrokuje privremeni gubitak polupropusnosti. Ovo omogućava izlazak mnogih unutarćelijskih sadržaja, kao što su ioni i metaboliti, kao i istovremeni unos lijekova, molekulskih sondi i nukleinskih kiselina. Za ćelije koje je teško transficirati, elektroporacija je korisna, ali ćelijska smrt je vjerojatnija pod ovom tehnikom.[26]

Ovaj metod korišten je za isporuku siRNK koja cilja VEGF u ksenotransplantne tumore golih miševa, što je rezultiralo značajnom supresijom rasta tumora.[27]

Virusno posredovana isporuka[uredi | uredi izvor]

Efekti utišavanja gena transficirane dizajnirane siRNK su općenito prolazni, ali ova poteškoća može se prevazići putem RNKi pristupa. Isporuka ove siRNK iz DNK šablona može se obaviti putem nekoliko rekombinantnih virusnih vektora, zasnovanih na retrovirusu, adeno-asociranom virusu, adenovirusi i lentivirusu.[28] Potonji je najefikasniji virus koji stabilno isporučuje siRNK ciljnim ćelijama jer može transducirati ćelije koje se ne dijele, kao i direktno ciljati ćelijsko jedro.[29] Ovi specifični virusni vektori sintetizovani su da efikasno olakšaju siRNK koja nije održiva za transfekciju u ćelije. Drugi aspekt je da u nekim slučajevima sintetski virusni vektori mogu integrirati siRNK u ćelijski genom, što omogućava stabilnu ekspresiju siRNk i dugotrajno utišavanje gena. Ova tehnika je korisna jer je i in vivo i efikasna za ćelije koje je teško transficirati. Međutim, nastaju problemi jer može izazvati antivirusne odgovore u nekim tipovima ćelija, što dovodi do mutagenih i imunskih efekata.

Ovaj metod ima potencijalnu upotrebu u utišavanju gena centralnog nervnog sistema za liječenje Huntingtonove bolesti.[30]

Također pogledajte[uredi | uredi izvor]

Reference[uredi | uredi izvor]

  1. ^ Laganà A, Veneziano D, Russo F, Pulvirenti A, Giugno R, Croce CM, Ferro A (2015). "Computational design of artificial RNA molecules for gene regulation". RNA Bioinformatics. Methods in Molecular Biology. 1269. str. 393–412. doi:10.1007/978-1-4939-2291-8_25. ISBN 978-1-4939-2290-1. PMC 4425273. PMID 25577393.
  2. ^ a b Monga I, Qureshi A, Thakur N, Gupta AK, Kumar M (2017). "ASPsiRNA: A Resource of ASP-siRNAs Having Therapeutic Potential for Human Genetic Disorders and Algorithm for Prediction of Their Inhibitory Efficacy". G3 (Bethesda, Md.). 7 (9): 2931–2943. doi:10.1534/g3.117.044024. PMC 5592921. PMID 28696921. Text was copied from this source, which is available under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
  3. ^ Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ (januar 2001). "Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference". Nature. 409 (6818): 363–6. Bibcode:2001Natur.409..363B. doi:10.1038/35053110. PMID 11201747. S2CID 4371481.
  4. ^ Qureshi A, Thakur N, Monga I, Thakur A, Kumar M (1. 1. 2014). "VIRmiRNA: a comprehensive resource for experimentally validated viral miRNAs and their targets". Database. 2014: bau103. doi:10.1093/database/bau103. PMC 4224276. PMID 25380780.
  5. ^ Mack GS (juni 2007). "MicroRNA gets down to business". Nature Biotechnology. 25 (6): 631–8. doi:10.1038/nbt0607-631. PMID 17557095. S2CID 35357127.
  6. ^ "RNA Interference (RNAi)". Pristupljeno 27. 7. 2018.
  7. ^ Sharei A, Zoldan J, Adamo A, Sim WY, Cho N, Jackson E, et al. (februar 2013). "A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6): 2082–7. Bibcode:2013PNAS..110.2082S. doi:10.1073/pnas.1218705110. PMC 3568376. PMID 23341631.
  8. ^ Daneholt, B. (2006). "Advanced Information: RNA interference". The Novel Prize in Physiology or Medicine.
  9. ^ Li L (2008). "Small RNA-Mediated Gene Activation". u Morris KV (ured.). RNA and the Regulation of Gene Expression: A Hidden Layer of Complexity. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-25-7.
  10. ^ De Hayr L, Asad S, Hussain M, Asgari S (2020). "RNA activation in insects: The targeted activation of endogenous and exogenous genes". Insect Biochem Mol Biol. 119: 103325. doi:10.1016/j.ibmb.2020.103325. PMID 31978586.CS1 održavanje: više imena: authors list (link)
  11. ^ Lee YS, Nakahara K, Pham JW, Kim K, He Z, Sontheimer EJ, Carthew RW (april 2004). "Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways". Cell. 117 (1): 69–81. doi:10.1016/s0092-8674(04)00261-2. PMID 15066283. S2CID 6683459.
  12. ^ a b Carthew RW, Sontheimer EJ (februar 2009). "Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs". Cell. 136 (4): 642–55. doi:10.1016/j.cell.2009.01.035. PMC 2675692. PMID 19239886.
  13. ^ Tomari Y, Zamore PD (mart 2005). "Perspective: machines for RNAi". Genes & Development. 19 (5): 517–29. doi:10.1101/gad.1284105. PMID 15741316.
  14. ^ Orban TI, Izaurralde E (april 2005). "Decay of mRNAs targeted by RISC requires XRN1, the Ski complex, and the exosome". RNA. 11 (4): 459–69. doi:10.1261/rna.7231505. PMC 1370735. PMID 15703439.
  15. ^ Ozata DM, Gainetdinov I, Zoch A, Phillip D, Zamore PD (2019). "PIWI-interacting RNAs: small RNAs with big functions" (PDF). Nature Reviews Genetics. 20 (2): 89–108. doi:10.1038/s41576-018-0073-3. PMID 30446728. S2CID 53565676.
  16. ^ Monga I, Banerjee I (2019). "Computational Identification of piRNAs Using Features Based on RNA Sequence, Structure, Thermodynamic and Physicochemical Properties". Current Genomics. 20 (2): 508–518. doi:10.2174/1389202920666191129112705. PMC 7327968. PMID 32655289.
  17. ^ Whitehead KA, Dahlman JE, Langer RS, Anderson DG (17. 6. 2011). "Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system". Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 2 (1): 77–96. doi:10.1146/annurev-chembioeng-061010-114133. PMID 22432611. S2CID 28803811.
  18. ^ Matsumiya T, Stafforini DM (2010). "Function and regulation of retinoic acid-inducible gene-I". Critical Reviews in Immunology. 30 (6): 489–513. doi:10.1615/critrevimmunol.v30.i6.10. PMC 3099591. PMID 21175414.
  19. ^ Barøy T, Sørensen K, Lindeberg MM, Frengen E (juni 2010). "shRNA expression constructs designed directly from siRNA oligonucleotide sequences". Molecular Biotechnology. 45 (2): 116–20. doi:10.1007/s12033-010-9247-8. PMID 20119685. S2CID 24309609.
  20. ^ Wittrup A, Lieberman J (septembar 2015). "Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics". Nature Reviews. Genetics. 16 (9): 543–52. doi:10.1038/nrg3978. PMC 4756474. PMID 26281785.
  21. ^ Dar SA, Thakur A, Qureshi A, Kumar M (januar 2016). "siRNAmod: A database of experimentally validated chemically modified siRNAs". Scientific Reports. 6 (1): 20031. Bibcode:2016NatSR...620031D. doi:10.1038/srep20031. PMC 4730238. PMID 26818131.
  22. ^ Hickerson RP, Smith FJ, Reeves RE, Contag CH, Leake D, Leachman SA, et al. (mart 2008). "Single-nucleotide-specific siRNA targeting in a dominant-negative skin model". The Journal of Investigative Dermatology. 128 (3): 594–605. CiteSeerX 10.1.1.465.8240. doi:10.1038/sj.jid.5701060. PMID 17914454.
  23. ^ Fanelli A (2016). "Transfection: In Vitro Transfection". Pristupljeno 5. 12. 2017.
  24. ^ Jensen K, Anderson JA, Glass EJ (april 2014). "Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation". Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3–4): 224–32. doi:10.1016/j.vetimm.2014.02.002. PMC 3988888. PMID 24598124.
  25. ^ Chatterjea MN (2012). Textbook of Medical Biochemistry (8th izd.). New Delhi: Jaypee Brothers Medical Publishers. str. 304.
  26. ^ "siRNA Delivery Methods into Mammalian Cells". 13. 10. 2016. Arhivirano s originala, 7. 3. 2022. Pristupljeno 7. 3. 2022.
  27. ^ Takei Y (2014). "Electroporation-mediated siRNA delivery into tumors". Electroporation Protocols. Methods in Molecular Biology. 1121. str. 131–8. doi:10.1007/978-1-4614-9632-8_11. ISBN 978-1-4614-9631-1. PMID 24510818.
  28. ^ Talwar GP, Hasnain S, Sarin SK (januar 2016). Textbook of Biochemistry, Biotechnology, Allied and Molecular Medicine (4th izd.). PHI Learning Private Limited. str. 873. ISBN 978-81-203-5125-7.
  29. ^ Morris KV, Rossi JJ (mart 2006). "Lentiviral-mediated delivery of siRNAs for antiviral therapy". Gene Therapy. 13 (6): 553–8. doi:10.1038/sj.gt.3302688. PMC 7091755. PMID 16397511.
  30. ^ Cambon K, Déglon N (2013). Lentiviral-mediated gene transfer of siRNAs for the treatment of Huntington's disease. Methods in Molecular Biology. 1010. str. 95–109. doi:10.1007/978-1-62703-411-1_7. ISBN 978-1-62703-410-4. PMID 23754221.

Dopunska literatura[uredi | uredi izvor]

Vanjski linkovi[uredi | uredi izvor]

Šablon:Prirodni antisens transkripti