Komplementarna DNK

S Wikipedije, slobodne enciklopedije
Idi na navigaciju Idi na pretragu
Ispoljavanje cDNK na DNK mikromreži u testiranju

U genetici, komplementarna DNK (cDNK) je DNK sintetizirana iz jednolančane RNK, npr. informacijska RNK (iRNK) ili mikroRNK (miRNK), predložak u reakciji koju katalizira enzim reverzna transkriptaza. cDNK se često koristi za kloniranje eukariotskih gena u prokariotima. Kada se želi eksprimirati određeni protein u ćeliji koja ga obično ne izražava (tj. heterologno ispoljava), prenijet će cDNK, koja kodira protein u ćeliju primatelja. U molekulskoj biologiji, cDNK se također generira za analizu transkriptomakog profila u rasutom tkivu, pojedinačnim ćelijama ili pojedinačnim jedrima. Koristi se u testovima kao što su mikromreže (mreže segmenata DNK poznate sekvence koja se upotrebljava za testiranje i mapiranje fragmenata DNK, antitela ili proteina) i RNK-sekv .

Komplementarna DNK se također prirodno proizvodi u retrovirusima (poput HIV-1, HIV-2, majmunskom virusu imunodiferencijacije, itd.), a zatim se integrira u genom domaćina, gdje stvara provirus.[1]

Također se koristi i termin cDNK, obično u bioinformatičkom kontekstu, kada se odnosi na transkripcijske sekvence iRNK, izražene kao baze DNK (deoksi-GCAT), a ne baze RNK (GCAU).

Sinteza[uredi | uredi izvor]

RNK služi kao predložak za sintezu cDNK.[2] U ćelijskim organizmima, cDNK generiraju virusi i retrotranspozoni za integraciju RNK u ciljnu genomsku DNK. U molekulskoj biologiji, RNK se prečišćava iz izvornog materijala, nakon uklanjanja genomske DNK, proteina i drugih ćelijskih komponenata. Tatim se cDNA sintetizira putem in vitro obrnute transkripcije.[3]

Prečišćavanje RNK[uredi | uredi izvor]

RNK se transkribira iz genomske DNK u ćelijama domaćina i ekstrahiranjem pomoću liziranja ćelija, a zatim prečišćava, koristeći široko korištene metode kao što su fenol-hloroform, kolona silicijevog dioksida i kuglični etodi ekstrakcije RNK.[4] Metodi ekstrakcije variraju ovisno o izvornom materijalu. Naprimjer, za ekstrakciju RNK iz biljnog tkiva potrebni su dodatni reagensi, poput polivinilpirolidona (PVP), za uklanjanje fenolnih spojeva, ugljikohidrata i drugih spojeva koji bi RNK učinili neupotrebljivom.[5] Za uklanjanje DNK i proteina koriste se enzimi kao što su DNaza i proteinaza K za razgradnju.[6] Važno je da se integritet RNK održava inaktivacijom RNaza sa haotropnim agensima, kao što su gvanidinij- izotiocijanat, natrij-dodecil sulfat (SDS), fenol ili hloroform. Ukupna RNK se zatim odvaja od ostalih ćelijskih komponenata i taloži alkoholom. Postoje razni komercijalni paketi za jednostavno i brzo ekstrahiranje RNK za određene primjene.[7] Dodatni metodi zasnovani na zrncima/kuglicama mogu se koristiti za izolaciju određenih podtipova RNK (npr. iRNK i mikroRNK) na osnovu veličine ili jedinstvenih regiona RNK.[8][9]

Obrnuta transkripcija[uredi | uredi izvor]

Sinteza prvog lanca[uredi | uredi izvor]

Korištenjem enzima reverzna transkriptaza i prečišćenih obrazaca RNK, stvara se jedna nit cDNK (sinteza prve niti cDNK). Obično se koristi M-MLV reverzna transkriptaza iz Moloneyedvog virusa mišje leukemije, zbog svoje smanjene aktivnosti RNKaze H pogodne za transkripciju dužih molekula RNK.[10] AMV-reverzna transkriptaza iz virusa mijeloblastoze ptica, također se može koristiti za predloške RNA s jakim sekundarnim strukturama (tj. visokom temperaturom topljenja).[11] Komplementarna DNK se obično generira iz iRNK, za analize ekspresije gena. kao što su RT-qPCR i RNK-sekv.[12] Informacijska RNK se selektivno prepisuje obrnuto pomoću prajmera oligo-dT, koji su reverzni komplementi poliadeniliranih repova na 3 'kraju svih iRNK. Optimizirana smeša oligo-dT i slučajnih heksamernih prajmera povećava šansu za dobijanje cDNK pune dužine, istovremeno smanjujući pristranost 5 'ili 3'.[13] Ribosomska RNK također može biti osiromašena, kako bi obogatila i iRNK i nepoli-adenilirane transkripte, kao što su neke nekodirajuće RNK.[14]

Sinteza drugog lanca[uredi | uredi izvor]

Rezultat sinteze prvog lanca, hibridni kompleks RNK-DNK, može se obraditi višestrukim metodima sinteze drugog lanca ili izravno u nizvodnim testovima.[15][16] Rani metod poznat kao sinteza ukosnicom, temeljila se na stvaranju ukosnice na 3 'kraju cDNK prvog lanca, da bi se sintetizirala druga nit. Međutim, temeljni premaz je slučajan, a hidroliza ukosnice dovodi do gubitka podataka. Gublerov i Hoffmanov postupak koristi E. coli RNazu H za nabiranje iRNK, koja je zamijenjena DNK-polimeraze E. coli I i njena završna DNK-ligaza. Optimizacija ovog postupka oslanja se na nisku aktivnost RNKaze H M-MLV da dobije iRNK s preostalom RNK, koja se kasnije uklanja dodavanjem RNaze H, nakon translacije DNK polimeraze cDNK drugog lanca. Ovo sprečava informacije o izgubljenim sekvencama na 5' kraju iRNK.

Primjena[uredi | uredi izvor]

Komplementarna DNK često se koristi u kloniranju gena ili kao genska sonda ili u stvaranju bibloteka cDNK. Kada se prenesu gen iz jedne ćelije u drugu kako bi eksprimirali novi genetički materijal kao protein u ćeliji primatelja, cDNK će se dodati primatelju (umjesto cijelom genu), jer DNK za cijeli gen može uključivati DNK koja ne kodira protein ili koja prekida kodirajuću sekvencu proteina (npr. introne). Djelimične sekvence cDNK se često dobijaju kao oznaka eksprimirane sekvence

Uz pojačavanje sekvenci DNK putem lančane reakcije polimeraze (PCR), koja je danas uobičajena, obično se provodi obrnuta transkripcija kao početni korak, nakon čega slijedi PCR da bi se dobio tačan slijed cDNK za unutarćelijsku ekspresiju. To se postiže dizajniranjem DNK specifičnih sekvenci za sekvence koje se hibridiziraju na 5 'i 3' krajeva cDNA regije koja kodira protein. Jednom pojačana, sekvenca se na svakom kraju može rezati nukleazama i umetnuti u jednu od mnogih malih kružnih sekvenci DNK, poznatih kao ekspresijski vektori. Takvi vektori omogućavaju samokopiranje unutar ćelija i potencijalnu integraciju u DNK domaćina. Tipično sadrže i snažni promotor koji pokreće transkripciju ciljne cDNK u iRNK, koja se zatim prevodi u protein.

Dana 13. juna 2013. godine, Vrhovni sud Sjedinjenih Država presudio je u slučaju "Udruženje za molekularnu patologiju" protiv Myriad Genetics da, iako se ljudski geni u prirodi ne mogu patentirati, cDNA je prihvatljiva za jer se ne javlja prirodno.[17]

Komplementarna DNK se također koristi za proučavanje ekspresije gena metodima poput RNK-sekv ili RT-qPCR.[18][19][20] Za sekvenciranje, svaka RNK mora biti fragmentirana zbog ograničenja veličine platforme za sekvenciranje. Pored toga cDNK sintetizirana drugim lancem mora se povezati adapterima koji omogućavaju PCR-pojačavanje cDNK fragmenata i vezanje za ćelijske protočne ćelije. Metodi analize specifične za gene obično koriste mikromreže i RT-qPCR za kvantifikaciju nivoa cDNK, pomoću fluorometrijskih i drugih metoda.

Virusi i retrotranspozoni[uredi | uredi izvor]

Neki virusi također koriste cDNK, da pretvore svoju virusnu RNK u iRNK (virusna RNK → cDNK → iRNK). Za stvaranje virusnih proteina koristi se iRNK, koji preuzimaju ćeliju domaćina.

Primjer ovog prvog koraka od virusne DNK do cDNK može se vidjeti u ciklusu infekcije HIV-om. Ovdje ćelijska membrana domaćina veže se za lipidnu ovojnicu virusa, koja omogućava stvaranje virusne kapside s dvije kopije RNK virusnog genoma da uđe u domaćina. Kopija cDNK zatim se pravi putem obrnute transkripcije virusne RNK, što je postupak olakšan šaperonom CypA i reverznom transkriptazom povezanom sa virusnom kapsidom.[21]

Komplementarna DNK također generira retrotranspozone u eukariotskim genomima. Retrotranspozoni su mobilni genetički elementi, koji se sami kreću unutar, a ponekad i između genoma putem intermedijera RNK. Ovaj mehanizam dijeli se s virusima, isključujući stvaranje zaraznih čestica.[22][23]

Također pogledajte[uredi | uredi izvor]

Reference[uredi | uredi izvor]

  1. ^ Croy, Ron. "Molecular Genetics II - Genetic Engineering Course (Supplementary notes)". Durham University durham.ac.uk; 20 April 1998. Arhivirano s originala, 24. 8. 2002. Pristupljeno 4. 2. 2015.
  2. ^ Ying, Shao-Yao (1. 7. 2004). "Complementary DNA libraries". Molecular Biotechnology (jezik: engleski). 27 (3): 245–252. doi:10.1385/MB:27:3:245. ISSN 1559-0305. PMID 15247497.
  3. ^ "5 Steps to Optimal cDNA Synthesis - US". www.thermofisher.com (jezik: engleski). Pristupljeno 12. 5. 2020.
  4. ^ Tavares, Lucélia; Alves, Paula M.; Ferreira, Ricardo B.; Santos, Claudia N. (6. 1. 2011). "Comparison of different methods for DNA-free RNA isolation from SK-N-MC neuroblastoma". BMC Research Notes. 4 (1): 3. doi:10.1186/1756-0500-4-3. ISSN 1756-0500. PMC 3050700. PMID 21211020.
  5. ^ R, Kansal; K, Kuhar; I, Verma; Rn, Gupta; Vk, Gupta; Kr, Koundal (decembar 2008). "Improved and Convenient Method of RNA Isolation From Polyphenols and Polysaccharide Rich Plant Tissues". Indian Journal of Experimental Biology (jezik: engleski). 46 (12): 842–5. PMID 19245182.
  6. ^ I, Vomelová; Z, Vanícková; A, Sedo (2009). "Methods of RNA Purification. All Ways (Should) Lead to Rome". Folia Biologica (jezik: engleski). 55 (6): 243–51. PMID 20163774.
  7. ^ Sellin Jeffries, Marlo K.; Kiss, Andor J.; Smith, Austin W.; Oris, James T. (14. 11. 2014). "A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples". BMC Biotechnology. 14 (1): 94. doi:10.1186/s12896-014-0094-8. ISSN 1472-6750. PMC 4239376. PMID 25394494.
  8. ^ "mRNA Isolation with Dynabeads in 15 minutes - US". www.thermofisher.com (jezik: engleski). Pristupljeno 20. 5. 2020.
  9. ^ Gaarz, Andrea; Debey-Pascher, Svenja; Classen, Sabine; Eggle, Daniela; Gathof, Birgit; Chen, Jing; Fan, Jian-Bing; Voss, Thorsten; Schultze, Joachim L.; Staratschek-Jox, Andrea (maj 2010). "Bead Array–Based microRNA Expression Profiling of Peripheral Blood and the Impact of Different RNA Isolation Approaches". The Journal of Molecular Diagnostics : JMD. 12 (3): 335–344. doi:10.2353/jmoldx.2010.090116. ISSN 1525-1578. PMC 2860470. PMID 20228267.
  10. ^ Haddad, Fadia; Baldwin, Kenneth M. (2010), King, Nicola (ured.), "Reverse Transcription of the Ribonucleic Acid: The First Step in RT-PCR Assay", RT-PCR Protocols: Second Edition, Methods in Molecular Biology (jezik: engleski), Humana Press, 630, str. 261–270, doi:10.1007/978-1-60761-629-0_17, ISBN 978-1-60761-629-0, PMID 20301003
  11. ^ Martin, Karen. "Reverse Transcriptase & cDNA Overview & Applications". Gold Biotechnology. Pristupljeno 20. 5. 2020.
  12. ^ "qPCR, Microarrays or RNA Sequencing - What to Choose?". BioSistemika (jezik: engleski). 10. 8. 2017. Pristupljeno 20. 5. 2020.
  13. ^ "cDNA Synthesis | Bio-Rad". www.bio-rad.com. Pristupljeno 28. 5. 2020.
  14. ^ Herbert, Zachary T.; Kershner, Jamie P.; Butty, Vincent L.; Thimmapuram, Jyothi; Choudhari, Sulbha; Alekseyev, Yuriy O.; Fan, Jun; Podnar, Jessica W.; Wilcox, Edward; Gipson, Jenny; Gillaspy, Allison (15. 3. 2018). "Cross-site comparison of ribosomal depletion kits for Illumina RNAseq library construction". BMC Genomics. 19 (1): 199. doi:10.1186/s12864-018-4585-1. ISSN 1471-2164. PMC 6389247. PMID 29703133.
  15. ^ Invitrogen. "cDNA Synthesis System" (PDF). Thermofisher. Pristupljeno 27. 5. 2020.
  16. ^ Agarwal, Saurabh; Macfarlan, Todd S.; Sartor, Maureen A.; Iwase, Shigeki (21. 1. 2015). "Sequencing of first-strand cDNA library reveals full-length transcriptomes". Nature Communications (jezik: engleski). 6 (1): 6002. Bibcode:2015NatCo...6.6002A. doi:10.1038/ncomms7002. ISSN 2041-1723. PMC 5054741. PMID 25607527.
  17. ^ Liptak, Adam (13. 6. 2013). "Supreme Court Rules Human Genes May Not Be Patented". The New York Times. Pristupljeno 14. 6. 2013.
  18. ^ Derisi, J.; Penland, L.; Brown, P. O.; Bittner, M. L.; Meltzer, P. S.; Ray, M.; Chen, Y.; Su, Y. A.; Trent, J. M. (decembar 1996). "Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer". Nature Genetics (jezik: engleski). 14 (4): 457–460. doi:10.1038/ng1296-457. ISSN 1546-1718. PMID 8944026.
  19. ^ White, Adam K.; VanInsberghe, Michael; Petriv, Oleh I.; Hamidi, Mani; Sikorski, Darek; Marra, Marco A.; Piret, James; Aparicio, Samuel; Hansen, Carl L. (23. 8. 2011). "High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR". Proceedings of the National Academy of Sciences (jezik: engleski). 108 (34): 13999–14004. Bibcode:2011PNAS..10813999W. doi:10.1073/pnas.1019446108. ISSN 0027-8424. PMC 3161570. PMID 21808033.
  20. ^ Hrdlickova, Radmila; Toloue, Masoud; Tian, Bin (januar 2017). "RNA-Seq methods for transcriptome analysis". Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1): e1364. doi:10.1002/wrna.1364. ISSN 1757-7004. PMC 5717752. PMID 27198714.
  21. ^ Altfeld, Marcus; Jr, Michael Gale (1. 6. 2015). "Innate immunity against HIV-1 infection". Nature Immunology (jezik: engleski). 16 (6): 554–562. doi:10.1038/ni.3157. ISSN 1529-2908. PMID 25988887.
  22. ^ Havecker, Ericka R.; Gao, Xiang; Voytas, Daniel F. (18. 5. 2004). "The diversity of LTR retrotransposons". Genome Biology. 5 (6): 225. doi:10.1186/gb-2004-5-6-225. ISSN 1474-760X. PMC 463057. PMID 15186483.
  23. ^ Cordaux, Richard; Batzer, Mark A. (oktobar 2009). "The impact of retrotransposons on human genome evolution". Nature Reviews Genetics (jezik: engleski). 10 (10): 691–703. doi:10.1038/nrg2640. ISSN 1471-0064. PMC 2884099. PMID 19763152.

Vanjski linkovi[uredi | uredi izvor]